[發(fā)明專利]用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810051728.1
• 申請(qǐng)日: 2008-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101440396A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建華;張楠;李巍;張西臣;宮鵬濤;李淑紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測(cè)芯片，具體涉及一種用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片，還涉及該芯片的制備方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隱孢子蟲(Cryptosproidium?spp.)包括：微小隱孢子蟲(C.parvum)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)、貝氏隱孢子蟲(C.baileyi)、火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)、人源隱孢子蟲(C.hominis)及豬隱孢子蟲(Porcine?Cryptosporidium)，是一種危害廣泛的人獸共患寄生蟲原蟲病，可造成哺乳動(dòng)物尤其是反芻動(dòng)物和人的嚴(yán)重腹瀉。

藍(lán)氏賈第蟲(Giardia?lambila?Stiles，1915)是一種世界范圍分布的人獸共患原蟲，它可引起人或動(dòng)物的藍(lán)氏賈第蟲病，主要癥狀是腹瀉。

隱孢子蟲與藍(lán)氏賈第蟲同屬水源性呈爆發(fā)性廣泛流行的原蟲，病理反應(yīng)均為嚴(yán)重腹瀉。因此，開(kāi)發(fā)一種特異靈敏的隱孢子蟲屬、微小隱孢子蟲種及藍(lán)氏賈第蟲的多重檢測(cè)方法已經(jīng)是迫在眉睫。

隱孢子蟲病與賈第蟲病的現(xiàn)行診斷方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷及分子生物學(xué)診斷三大類。病原學(xué)診斷多通過(guò)糞便顯微鏡檢及改良的抗酸染色法檢查，此法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且檢出率低下。免疫學(xué)診斷有間接血凝試驗(yàn)(IHA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、單克隆抗體(McAb)等方法，然這些免疫學(xué)方法特異性和敏感性都也較低。PCR技術(shù)是一種特異敏感直觀的檢測(cè)方法，其特異性檢測(cè)可以通過(guò)分析屬特異及種特異的診斷序列，設(shè)計(jì)屬和種特異引物，其敏感性可通過(guò)優(yōu)化擴(kuò)增條件來(lái)提高，最后通過(guò)電泳分析直接觀察擴(kuò)增結(jié)果。但是，PCR存在著較高的假陽(yáng)性機(jī)率，其敏感性也有所欠缺，

目前尚未有用于檢測(cè)隱孢子蟲及藍(lán)氏賈第蟲的懸浮芯片的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開(kāi)一種用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片，可以同時(shí)檢測(cè)隱孢子蟲與藍(lán)氏賈第蟲。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述芯片的制備方法，適用工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的懸浮芯片：

包括診斷引物和與微球耦聯(lián)的特異性寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針序列為隱孢子蟲種或?qū)偬禺惢蛸Z第蟲種特異性的基因中的一段序列。

隱孢子蟲種特異診斷序列：一段指狀U1核內(nèi)小分子核糖核蛋白基因，NCBI中比對(duì)僅為人源和微小隱孢子蟲所共有，同源性均為100％，符合種特異檢測(cè)研究標(biāo)準(zhǔn)。

隱孢子蟲屬特異診斷序列：18SrRNA基因(此基因?yàn)殡[孢子蟲的各個(gè)種所共有且是種間基因變異最小的一段基因)序列中保守的部分，在NCBI中比對(duì)為多個(gè)隱孢子蟲種共有，且同源性大于98％，符合屬特異檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

賈第蟲種特異診斷序列：beta-giardin，該序列經(jīng)國(guó)外重多學(xué)者驗(yàn)證具有良好的種特異性，是常用的賈第蟲基因分型和鑒別診斷基因。根據(jù)以上屬特異和種特異診斷序列設(shè)計(jì)特異性診斷引物及探針如下：

隱孢子蟲種特異引物H及探針ProH：

HF：5’-Biotin-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3’

HR：5’-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3

ProH探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CTTTCGGACCTCTTCCTCATC-3’

隱孢子蟲屬特異引物C及探針ProC：

CF：5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’

CR：5’-Biotin-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’

ProC探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-ACTCACCAGGTCCAGACATAG-3’

藍(lán)賈第蟲種特異引物G及探針ProG：

GF：5’-TACGCTCACCCAGACGATG-3’

GR：5’-Biotin-TCGGCGGACTTCTTGACCT-3’

ProG探針序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CAGCAACATGAACCAGCG-3’

以上三段寡聚核苷酸探針序列均在5’進(jìn)行NH₂-(CH₂)₁₂修飾。H上游引物、C與G的下游引物均用Biotin標(biāo)記，上述引物可擴(kuò)增包含上述探針序列的三段特異的診斷序列。