[發(fā)明專利]一種生物轉(zhuǎn)化二醇型人參皂甙Rb1的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810051621.7
• 申請(qǐng)日: 2008-12-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101748183A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周義發(fā);臺(tái)桂花;趙雪淞;高娟;付玲;孫成新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P33/00
• 分類號(hào): C12P33/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種利用真菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂甙的方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)??人參是中國(guó)名貴中藥。人參皂甙是人參重要的活性成分，具有多種生物活性。Rb1、Rd、Rg3均屬于人參皂甙。Rb1的含量最多，其次是Rd，Rg3的含量最少。Rg3具有多種藥理作用：預(yù)防和治療癌癥，改善心臟血管功能，抗血小板凝集，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，提高集體免疫力，抗疲勞，抗血栓，保肝，降低膽固醇，且無(wú)依賴性，對(duì)正常組織無(wú)毒性；尤其是明顯的抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的功能，使其成為許多國(guó)家研究的熱點(diǎn)。利用生物轉(zhuǎn)化可以將Rb1轉(zhuǎn)化成Rd或者Rg3。

發(fā)明內(nèi)容??本發(fā)明提供一種利用真菌將含量高的人參皂甙Rb1轉(zhuǎn)化為含量低、藥效高的人參皂甙Rd或者Rg3的方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：利用番茄葉霉(Cladosporium?fulvum)高效轉(zhuǎn)化Rb成Rd或者Rg3。包括以下步驟：

a)活化菌種：無(wú)菌操作接種于V-8汁固體培養(yǎng)基、90cm培養(yǎng)皿，25℃恒溫暗培養(yǎng)5-10天；

b)刮取孢子：無(wú)菌條件下，刮下平板上的菌絲和孢子，用無(wú)菌水沖洗平板若干次，將菌絲及孢子全部轉(zhuǎn)移到無(wú)菌水中。向含有菌絲及孢子的無(wú)菌水中加入玻璃珠，室溫振蕩1-2h，使孢子充分分散。四層紗布過(guò)濾，濾液離心，棄去上清，得到孢子(沉淀)；

c)液體培養(yǎng)：將孢子加入到V-8液體培養(yǎng)基(不含瓊脂)中，28℃、150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)；

d)濾取新生菌絲：將液體培養(yǎng)48h-72h的孢子懸液用四層紗布過(guò)濾，得到新生菌絲；

e)生物轉(zhuǎn)化：將新生菌絲加入到含有人參皂甙的醋酸緩沖液中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔24小時(shí)取出1組轉(zhuǎn)化液離心，棄去菌體，取上清液加水飽和正丁醇終止反應(yīng)，TLC檢測(cè)。

f)回收皂甙：用正丁醇終止反應(yīng)，同時(shí)皂甙產(chǎn)物被萃取至有機(jī)層中。將有機(jī)層水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛∶水＝35∶65)溶解，進(jìn)行柱層析分離制備稀有人參皂甙純品。

具體實(shí)施方式

1.活化菌種：無(wú)菌操作接種于V-8汁固體培養(yǎng)基，25℃恒溫暗培養(yǎng)5-10天。

2.刮取孢子：無(wú)菌條件下，刮下平板上的菌絲和孢子，用無(wú)菌水沖洗平板若干次，將菌絲及孢子全部轉(zhuǎn)移到無(wú)菌水中。向含有菌絲及孢子的無(wú)菌水中加入玻璃珠，室溫振蕩1-2h，200rpm，使孢子充分分散。

3.液體培養(yǎng)：四層紗布過(guò)濾培養(yǎng)液，濾液離心，棄去上清，得到孢子；將孢子加入到200mL的V-8液體培養(yǎng)基中，稀釋調(diào)整濃度為5×10⁶個(gè)/ml，28℃、150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)。

4.擴(kuò)大培養(yǎng)：將液體培養(yǎng)48h-72h的孢子懸液用四層紗布過(guò)濾，得到新生菌絲。

5.生物轉(zhuǎn)化：將新生菌絲加入到400ml醋酸緩沖液(0.2M，pH?5)中，調(diào)整其濃度為5×10⁶個(gè)/ml，加入人參皂甙Rb1，終濃度為0.25mg/ml，，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)8天。

6.回收皂甙：離心，6000rpm，20min，取上清液，按正丁醇與培養(yǎng)液體積比1∶2的比例，加水飽和正丁醇，皂甙產(chǎn)物被萃取至有機(jī)層中。重復(fù)三次，合并有機(jī)液。將有機(jī)層水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛∶水＝35∶65)溶解，進(jìn)行HPLC分離制備稀有人參皂甙純品，得到人參皂甙Rd?68mg。