[發明專利]一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法

無效

• 申請號: 200810051514.4
• 申請日: 2008-12-03
• 公開（公告）號: CN101412973A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發明（設計）人: 王丕武;李曉婷;付永平;曲靜
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12N9/42;C12N9/24;C12R1/85
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 魏征驥

技術領域

本發明涉及一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法。

背景技術

半纖維素酶是降解木糖、葡糖糖、甘露糖和五碳糖的一組酶的總稱。木聚糖酶是半纖維素酶的主要酶之一。木聚糖酶是一組可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的復合酶系。由于木聚糖分子結構復雜，含有許多不同的取代基。因此，木聚糖的生物降解就需要一個復雜的酶系統中不同組分之間的協同作用，才能將其轉化為基本單糖。作用于主鏈的有兩種酶：β-1，4-內切木聚糖酶和β-木糖苷酶。

(1)β-1，4-內切木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanxylanohydrolase，EC3.2.1.8.)，一般而言，內切木聚糖酶的作用是切開木聚糖主鏈內的糖苷鏈，降低基質的聚合度。在內切木聚糖酶作用的前期，所形成的主要產物是聚合度較大的低聚木糖，隨著水解的深入主要生成木三糖、木二糖，但一般不會生成木糖。

(2)β-木糖苷酶(β-xylanxylohydrolase，EC3.2.1.37)，β-木糖苷酶，是木聚糖的外切水解酶，主要水解短鏈的低聚木糖或木二糖，并從非還原性末端釋放出木糖。木二糖是此酶的最后底物，酶對低聚木糖的親和性隨聚合度的增加而降低。

作為粗纖維的一種，半纖維素廣泛應用于飼料當中。但單胃動物從日糧中攝取的半纖維素會在腸道中形成高黏性多糖，從而阻止蛋白質、脂肪的消化吸收，降低飼料的轉化率。同時高黏度多糖通過改變腸細胞轉換速率、內源性酶合成速率、微生物區系及球蟲數量來影響動物的生產性能。半纖維素酶能將植物細胞壁中半纖維素分解成葡萄糖，同時還可解除細胞壁對其他營養成分的封阻作用，所以在飼料中添加半纖維素酶具有非常重要的意義。

由黑曲霉發酵產生的微生物半纖維素酶能夠提高肉雞對大豆粕中粗纖維的利用率。但在相當長的歷史時期內，由于生產成本高、活性低、穩定性差等問題，一直未能進入實用階段。隨著生物技術和發酵工藝的發展，發達國家環保意識的提高，半纖維素酶的研究和應用重新被提到議事日程上來。目前微生物半纖維素酶已在西歐和各國廣泛地用于畜禽生產。以往工業上生產的半纖維素酶是以自然界存在的微生物產生具有高性能的自然酶為基礎。現通過基因工程技術，用經選擇在廉價原料中容易培養并且發酵液中容易純化酶的宿主微生物來生產。通過基因工程技術可在生物體間轉移基因，而且還可以修飾結構基因，從而使生產過程易進行，并可按應用要求剪接得到具有特有性能的酶。國內外對半纖維素酶展開了大量的研究，研究的領域不斷擴大，取得了許多進展。近十幾年來，人們對真菌半纖維素酶基因的克隆與表達做了大量的研究。黑曲霉(Aspergillus?niger)所產生的半纖維素酶的降解作用日益受到重視，國內外對這方面的研究也日益增多。隨著轉基因技術的不斷成熟，黑曲霉木聚糖酶基因在基因工程上的應用，逐漸引起人們的關注。

粟酒裂殖酵母(S.pombe)是一種單細胞的、真核生物，擁有同高等生物極其相似的屬性：染色體結構和功能、細胞循環的控制以及RNA的拼接，這些屬性使S.pombe成為生產真核蛋白的理想系統。用粟酒裂殖酵母作為宿主直到最近才引起重視，國外目前利用裂殖酵母成功表達外源蛋白的例子很多，但國內研究報道極少。2002年2月基因組的測序及其各基因功能的取得更有利于研究外源蛋白在粟酒裂殖酵母中的表達。S.pombe被用來通過基因互補來克隆真核基因，意味著在S.pombe中異質基因的表達是活躍的。利用各種表達構建大量的polyoma?virus?middle-T抗原、the?humanantithrombinIII、the?human?liver?epoxide?hydrolase、the?human?blood?coagulation?factorXIIIa、the?human?lipocortin?I、rat?arginase、rat?NDP-kinase、humaninterleukin-6(IL-6)、Arabidopsis?thaliana?sugar?transporter?STP1等高等真核基因，已在S.pombe被表達和純化。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法。

本發明所提供的重組粟酒裂殖酵母工程菌，是將構建含有半纖維素酶基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵母中得到的。