[發(fā)明專利]一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810051514.4
• 申請(qǐng)日: 2008-12-03
• 公開（公告）號(hào): CN101412973A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王丕武;李曉婷;付永平;曲靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12N9/42;C12N9/24;C12R1/85
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 魏征驥

1、一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，是將構(gòu)建的含有半纖維素酶基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體導(dǎo)入粟酒裂殖酵母中得到的。

2、如權(quán)利要求1所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征是將半纖維素酶基因插入到粟酒裂殖酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處，將構(gòu)建的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入粟酒裂殖酵母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)重組粟酒裂殖酵母使半纖維素酶基因得到分泌表達(dá)。

3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體含有Pnmt1啟動(dòng)子、半纖維素酶基因、Pnmt1終止子序列、以及篩選標(biāo)志。

4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體含有半纖維素酶基因?yàn)閮?nèi)切木聚糖酶基因XYNB，其序列如SEQ?IDNO.1所述和木糖苷酶基因XLND，其序列如SEQ?ID?NO.2所述。

5、根據(jù)權(quán)利要求4所述具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：內(nèi)切木聚糖酶XYNB基因位于粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC的多克隆位點(diǎn)處的XhoI和SalI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體為pESPUC-XYNB，獲得的重組粟酒裂殖酵母工程菌為SP-Q01/pESPUC-XYNB，所述半纖維素酶XLND基因位于粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC的多克隆位點(diǎn)處的BamHI和NotI限制性酶酶內(nèi)切位點(diǎn)之間，構(gòu)建的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體為pESPUC-XLND，獲得的重組粟酒裂殖酵母菌株為SP-Q01/pESPUC-XLND。

6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于：篩選標(biāo)志一種為氨芐青霉素抗性基因(ampicillin?resistance?Amp⁺)，其允許在大腸桿菌(E.coli)克隆時(shí)進(jìn)行載體的復(fù)制和抗生素選擇；另一種為選擇標(biāo)記基因LEU2-d，源自釀酒酵母(Saccharomy?cescerevisiea)可以作為向粟酒裂殖酵母(S.pombe)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化表達(dá)結(jié)構(gòu)的選擇標(biāo)定物亮氨酸。

7、根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：半纖維素酶基因的表達(dá)是將構(gòu)建的含有半纖維素酶基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA，采用電穿孔法導(dǎo)入粟酒裂殖酵母SP-Q01中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子使半纖維素酶基因得到分泌表達(dá)。

8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：重組粟酒裂殖酵母在表達(dá)半纖維素酶基因無須加入誘導(dǎo)物，半纖維素酶基因前端自帶的信號(hào)肽序列可使半纖維素酶基因獲得分泌表達(dá)，表達(dá)時(shí)間為2～6天。