[發(fā)明專利]一種利用細菌纖維素膜做載體固定化白腐真菌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810051379.3
• 申請日: 2008-10-29
• 公開（公告）號: CN101392246A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發(fā)明（設計）人: 于大禹;張金榜;徐富超;關曉輝;劉文超;崔長龍;沈凌宏;林娟
• 申請（專利權）人: 東北電力大學
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12N1/14;C12N3/00;C12P19/04;C12R1/645;C12R1/02
• 代理公司: 吉林市達利專利事務所
• 代理人: 張瑜聲

1、一種利用細菌纖維素膜做載體固定化白腐真菌的方法，是

由如下的過程和步驟組成：

(1)白腐真菌White?rot?fungi的分離及孢子液的制備

A.白腐真菌的分離：取腐木2g加入滅菌后的100mL液體培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中30℃恒溫培養(yǎng)，隨時觀察培養(yǎng)基中菌的生長狀況；所述的液體培養(yǎng)基中各組分占液體培養(yǎng)基質量用量百分比分別為：KH₂PO₄?0.02％，MgSO₄·7H₂O?0.005％，CaCl₂?0.001％，葡萄糖1％，NH₃Cl?0.02％，H₂O₂?0.05％，酒石酸鈉0.028％，琥珀酸鈉0.054％，馬鈴薯提取液為液體培養(yǎng)基體積的0.05％，其中馬鈴薯提取液為200g馬鈴薯在1L蒸餾水中煮沸30分鐘后，用16層紗布過濾掉不溶物制得；121℃滅菌30分鐘；48小時后，取該培養(yǎng)液10mL重復進行富集培養(yǎng)，經3次富集培養(yǎng)后，取最終富集液在固定培養(yǎng)基平板上進行涂布培養(yǎng)；所述的固體培養(yǎng)基中各組分占固體培養(yǎng)基質量用量百分比分別為：葡萄糖2％，KH₂PO₄?0.3％，MgSO₄·7H₂O?0.15％，維生素B1?0.0005％，瓊脂1.2％，馬鈴薯提取液占固體培養(yǎng)基體積用量百分比為80％；121℃滅菌30分鐘；24小時后，在平板上挑取白色絨形的菌種進行劃線分離，待出現白色菌絲后，挑取單個菌落再劃線分離，直至重復得到純的單菌株，斜面保存，備用；

B.白腐真菌孢子液的制備：從上述步驟A.得到的白腐真菌保存斜面挑取少量菌絲，劃線法接種于固體培養(yǎng)基上，所述的固體培養(yǎng)基的組成與步驟A中的固體培養(yǎng)基相同，30℃培養(yǎng)5天后，白腐真菌孢子大量擴增，用無菌水輕輕洗出平板表面上的分生孢子，并在無菌條件下用16層濾布濾除菌塊，得到乳白色孢子懸浮液為白腐真菌孢子液，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)細菌纖維素膜的制備

A.木醋桿菌Acetobacter?xylinum的分離：將醋醅稀釋100倍后接種于50mL富集培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)基中各組分占富集培養(yǎng)基質量用量百分比分別為：葡萄糖5％；酵母膏0.5％；乙酸鈉0.2％；CaCO₃?1％；用乙酸調節(jié)pH至5.0；121℃下滅菌30分鐘后，加入占富集培養(yǎng)基體積用量百分比為2％的無水乙醇和質量用量百分比為0.5％的制霉菌素，再于28℃溫度下培養(yǎng)5天，液面長有乳白色膠質菌膜者為陽性；揭去富集培養(yǎng)基表面的凝膠膜，將此膜仔細貼在第一塊分離培養(yǎng)基平板上；所述的分離培養(yǎng)基中各組分占分離培養(yǎng)基質量用量百分比分別為：葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na₂HPO₄·12H₂O?0.2％；KH₂PO₄?0.1％；MgSO₄·7H₂O?0.025％；檸檬酸0.2％；瓊脂2％；pH5.8；121℃滅菌30分鐘；再取出貼在第二塊平板，如此再重復6次；平板置于28℃培養(yǎng)48小時后挑取單個菌落接入斜面，再經連續(xù)三次劃線分離得到灰白色純菌種；

B.細菌纖維素膜的產生：從步驟A的斜面挑取篩選到的木醋桿菌單菌落接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分用量占發(fā)酵培養(yǎng)基質量用量的百分比分別為：葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na₂HPO₄·12H₂O?0.2％；KH₂PO₄?0.1％；MgSO₄·7H₂O0.025％；檸檬酸0.2％；pH5.8；于121℃滅菌30分鐘，28℃靜置培養(yǎng)5天后，在液面生成乳白色或淡黃色膠質菌膜；將膜取出，用蒸餾水反復沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質；再將膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除菌膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明；然后用蒸餾水和0.5％的重量百分含量的乙酸反復沖洗至中性，再于80℃干燥至恒重，得到細菌纖維素膜；

(3)細菌纖維素膜的改性處理

在500mL帶塞錐形瓶中，分別加入環(huán)氧氯丙烷20～30mL，無水乙醇5～10mL，高氯酸1～2mL，蒸餾水3～6mL，用甲苯稀釋至100～200mL，搖勻后，加入2～4g上述步驟(2)得到的細菌纖維素膜，在60℃恒溫水浴中加熱4～6小時，待反應完畢后，取出膜用丙酮洗滌，以除掉膜上殘留的小分子有機物，置于80℃條件下烘干；將烘干的膜置于另一500mL錐形瓶中加入乙二胺6～12mL，蒸餾水100～200mL，充分振搖后，在80℃恒溫水浴中加熱4～6小時，然后取出膜用蒸餾水洗至中性，再用1％的重量百分含量的鹽酸洗滌后，仍用蒸餾水洗至中性，最后經丙酮潤洗，自然風干，得到改性細菌纖維素膜；

(4)固定化細胞的制備

向250mL錐形瓶中加入1～2g上述步驟(3)得到的改性細菌纖維素膜載體，再加入20～30mL?0.03mol/L，pH＝7.0的磷酸緩沖液；以及10～15mL的25％重量百分含量的戊二醛溶液，在40℃水浴中反應1～2小時，取出膜依次用100mL蒸餾水和100mL0.03mol/LpH＝7.0的磷酸緩沖溶液洗滌，然后自然風干；在另一250mL錐形瓶中加入上述戊二醛處理過的細菌纖維素載體、15～20mL0.03mol/L?pH＝7.0的磷酸緩沖溶液、10～20mL上述步驟(1)得到的備用的白腐真菌孢子液，密封好，于4℃下放置12小時，取出膜依次用250mL4℃的含0.5mol/L?NaCl的0.03mol/L磷酸緩沖溶液，其pH＝7.0，以及50mL4℃的0.03mol/L?pH＝7.0的磷酸緩沖溶液洗滌，得到乳白色的細菌纖維素膜固定化白腐真菌。