[發明專利]一種利用細菌纖維素膜做載體固定化白腐真菌的方法

無效

• 申請號: 200810051379.3
• 申請日: 2008-10-29
• 公開（公告）號: CN101392246A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 于大禹;張金榜;徐富超;關曉輝;劉文超;崔長龍;沈凌宏;林娟
• 申請（專利權）人: 東北電力大學
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12N1/14;C12N3/00;C12P19/04;C12R1/645;C12R1/02
• 代理公司: 吉林市達利專利事務所
• 代理人: 張瑜聲

技術領域

本發明屬于應用微生物與細胞工程技術領域，涉及一種固定化載體制備的方法及利用此載體固定化細胞的方法。特別涉及一種利用細菌纖維素膜做載體固定化白腐真菌的方法。

背景技術

白腐真菌(White?rot?fungi)是一類腐生的絲狀真菌，由于其分泌的胞外木質素降解酶具有非特異性和無需底物誘導的獨特性能，使得它對許多結構不同、高毒性、高分子難降解有機物具有廣譜的降解能力，在造紙工業的生物制漿和紙漿生物漂白、水污染控制和土壤修復等方面具有重要的應用價值。

雖然白腐真菌被廣泛地應用于降解各種環境污染物，但其在懸浮培養降解體系中，還存在諸多問題，如：處理效率有待提高，酶系統穩定性差，抗逆性、抗毒性、抗高負荷能力差，對溫度、pH和污染物濃度等運行參數要求較高，產泥量大，固液分離困難等。而大量國內外研究表明，將固定化細胞技術引入白腐真菌對環境污染物的降解過程能很好的克服以上問題。

固定化白腐真菌常用的方法有包埋法、吸附法等，常用的固定化載體有木屑、聚氨酯泡沫、活性炭、聚乙烯醇、海藻酸鈣等。但上述載體在實際應用過程中還存在著一些問題，如制備過程較復雜、固定化效率低、對白腐真菌活性影響大、操作穩定性差、廢棄后易對環境造成二次污染等。細菌纖維素膜是一種由微生物合成的超微純纖維素薄膜，由毗喃葡萄糖單體以β-1，4糖苷鍵連接而成的直鏈多糖，相鄰的毗喃葡萄糖的6個碳原子不在一個平面上，而是呈穩定的椅式立體結構，幾個鄰近的β-1，4葡聚糖鏈在分子內或分子間氫鍵的作用下形成不溶于水和有機溶劑的高分子聚合物。具有高的結晶度，超細納米纖維網絡，高的重合度，生物適應性強，可在自然界直接降解等獨特的性質。目前有研究將細菌纖維素作為載體用于多種酶的固定化，其作為是一種新型納米材料，已經成為國內外研究的熱點。

發明內容

本發明的目的是：通過對細菌纖維素膜進行改性處理，使其成為微生物固定化的優良載體，進而建立一種固定化白腐真菌的簡單、有效的方法，固定化后的白腐真菌具有活性更加穩定，抗干擾能力更強，能夠重復使用等特點。

上述目的是通過如下的技術方案來實現的：

一種利用細菌纖維素膜做載體固定化白腐真菌的方法，是由如下的過程和步驟組成：

一種利用細菌纖維素膜做載體固定化白腐真菌的方法，是由如下的過程和步驟組成：

(1)白腐真菌White?rot?fungi的分離及孢子液的制備

A.白腐真菌的分離：取腐木2g加入滅菌后的100mL液體培養基中，置于生化培養箱中30℃恒溫培養，隨時觀察培養基中菌的生長狀況；所述的液體培養基中各組分占液體培養基質量用量百分比分別為：KH₂PO₄?0.02％，MgSO₄·7H₂O?0.005％，CaCl₂?0.001％，葡萄糖1％，NH₃Cl?0.02％，H₂O₂?0.05％，酒石酸鈉0.028％，琥珀酸鈉0.054％，馬鈴薯提取液為液體培養基體積的0.05％，其中馬鈴薯提取液為200g馬鈴薯在1L蒸餾水中煮沸30分鐘后，用16層紗布過濾掉不溶物制得(以下同)，121℃滅菌30分鐘；48小時后，取該培養液10mL重復進行富集培養，經3次富集培養后，取最終富集液在固定培養基平板上進行涂布培養；所述的固體培養基中各組分占固體培養基質量用量百分比分別為：葡萄糖2％，KH₂PO₄?0.3％，MgSO₄·7H₂O?0.15％，維生素B1?0.0005％，瓊脂1.2％，馬鈴薯提取液占固體培養基體積(指未加入瓊脂前的體積，以下同)用量百分比為80％，121℃滅菌30分鐘；24小時后，在平板上挑取白色絨形的菌種進行劃線分離，待出現白色菌絲后，挑取單個菌落再劃線分離，直至重復得到純的單菌株，斜面保存，備用；

B.白腐真菌孢子液的制備：從上述步驟A.得到的白腐真菌保存斜面挑取少量菌絲，劃線法接種于固體培養基上，所述的固體培養基的組成與步驟A中的固體培養基相同，30℃培養5天后，白腐真菌孢子大量擴增，用無菌水輕輕洗出平板表面上的分生孢子，并在無菌條件下用16層濾布濾除菌塊，得到乳白色孢子懸浮液為白腐真菌孢子液，4℃冰箱保存備用；

(2)細菌纖維素膜的制備