[發明專利]乳酸菌單質粒Nisin誘導表達載體的構建及使用方法

無效

• 申請號: 200810051043.7
• 申請日: 2008-08-01
• 公開（公告）號: CN101638665A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 王春鳳;郝鳳奇
• 申請（專利權）人: 王春鳳;郝鳳奇
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 紀 尚

技術領域：

本發明屬于生物技術領域。?

背景技術

1乳酸菌的定義、分布?

乳酸菌(Lactic?acid?bacteria，LAB)是一群可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌總稱。該類菌為革蘭氏陽性、呈球狀或桿狀、過氧化氫酶陰性、消耗的葡萄糖50％以上用于產生乳酸；不形成芽孢、不運動或運動力較弱；可分解蛋白質，但不產生腐敗產物；對脂肪分解能力較弱。?

乳酸菌在自然界中分布較廣，包括人和動物的消化系統、呼吸系統、泌尿生殖系統、口腔系統、皮膚系統和排泄物，乳汁和乳制品，植物的果實、根莖和枝葉，腐爛的植物體，發酵的動物性食品和飲料，堆肥、土壤和淤泥、污水，以及若干種臨床樣品等^[2]。?

2乳酸菌的益生功能?

2.1促進營養成分的分解、吸收?

乳酸菌的菌體蛋白可增加蛋白質含量，能將食物中的大分子蛋白質，部分降解為小分子肽和游離氨基酸，利于胃腸消化吸化；乳酸菌可分解乳糖成為葡萄糖和半乳糖，進而進一步分解為小分子化合物，有助于兒童腦及神經系統的發育；乳酸菌在代謝過程中消耗部分維生素，有利于增加腸內維生素的穩定性；乳酸菌還可產生有機酸使鈣、磷、鐵等元素處于易吸收的離子狀態，提高其利用率。?

2.2抑菌抗病?

乳酸菌的抗菌功能要歸因于其代謝產物，這些代謝產物包括酸性物質(乳酸、乙酸等)、乳酸菌素(羊毛硫抗生素、肽類乳酸菌素、蛋白類乳酸菌素和復合型乳酸菌素)、二氧化碳(CO₂)和過氧化氫(H₂O₂)等。其中酸性物質可以消耗細菌大量細胞能量并影響細胞膜的穩定性；乳酸菌素可作用于細菌細胞膜，造成膜內物質和能量的泄漏。異型發酵的乳酸菌可發酵己糖產生CO₂以抑制霉菌和一些革蘭氏陰性菌，但對一些酵母菌和乳桿菌則無效。?

2.3調節消化道微生態平衡?

乳酸菌能有序地定植于人和動物黏膜、皮膚等表面或細胞之間，占據宿主消化道的定植?位點，形成生物屏障，減少病原微生物的侵染、定植，起著占位、爭奪營養、拮抗的作用，保護機體不被病原菌侵入。?

2.4有效降低血清中膽固醇含量?

Gililand等于1985年指出，在含有適量膽酸鹽的高膽固醇培養基中，嗜酸乳桿菌可通過同化膽固醇到自身的細胞膜中而降低培養基膽固醇的含量；隨后Rasic等也證實了嗜酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌對膽固醇的脫除作用。?

2.5有效緩解高血壓?

乳酸菌通過胞外蛋白酶、肽酶(羧肽酶、氨肽酶)將食物中的乳蛋白降解成對ACE有抑制作用的小肽和寡肽。如Lb.caseiYIP?9018的細胞壁成分和胞外多糖在高血壓患者體內表現出降血壓作用，有些乳酸桿菌在腸道內促進具有調節血壓作用的礦物質的吸收。?

2.6增強腸道黏膜免疫?

乳酸菌可增強機體的黏膜免疫，在健康及疾病個體中，乳酸菌通過激活吞噬細胞、提高細胞因子水平、增加自然殺傷細胞活性(NK細胞)和提高免疫球蛋白水平，最終誘導機體增強免疫反應強度。?

乳酸菌作為人類和動物腸道內的益生菌已被公認為是“安全等級”的微生物(Generallyregarded?as?safe，GRAS)，能否以其作為受體菌，表達對人類和動物健康有益的功能性蛋白質吸引了眾多國內外學者的目光。伴隨著分子生物學研究領域的不斷深入，自20世紀80年代以來，乳酸菌DNA重組技術日漸完善，一系列適合乳酸菌的遺傳工具(如：表達載體)應運而生。這使得以質粒載體作為基因的運載工具，將功能性基因裝配到乳酸菌中表達出符合人們需求的蛋白質成為可能。因此，能否構建出高效的乳酸菌表達載體一度成為制約該領域發展的瓶頸因素。?

3乳酸菌表達載體的研究現狀?

經過十幾年的努力，也已構建了一些適合乳酸菌的表達載體，這些載體按照啟動子的類型可分為組成型表達載體和誘導型表達載體。?

3.1組成型表達載體?