[發明專利]乳酸菌單質粒Nisin誘導表達載體的構建及使用方法

無效

• 申請號: 200810051043.7
• 申請日: 2008-08-01
• 公開（公告）號: CN101638665A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 王春鳳;郝鳳奇
• 申請（專利權）人: 王春鳳;郝鳳奇
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 紀 尚

1.乳酸菌單質粒Nisin誘導表達載體，它是由下述方法制備的：

a.雙組分調控元件nisRK基因的獲得及鑒定

(1)產Nisin乳酸乳球菌染色體DNA的制備

將-70℃凍存的產Nisin乳酸乳球菌接種于新鮮的MRS液體培養基中復蘇，復蘇后菌液涂布MRS培養 平板上，37℃恒溫厭氧培養過夜后挑取單個菌落接種于新鮮MRS液體培養基中進行培養，待菌體OD₆₀₀值 為0.6～0.8時，收集菌體，提取染色體DNA，-20℃保存備用；

(2)引物的設計與合成

根據GenBank登錄的nisRK基因序列GI：473019，采用Primer?5.0分子生物學軟件進行引物設計，上 下游引物分別加入Xba?I和Kpn?I酶切位點，每條引物全長27bp，由寶生物工程(大連)有限公司合成；引 物序列如下：

上游引物P1：GGG?TCT?AGA?GGA?GGT?AAA?GTG?GTG?TAT；

下游引物P2：GCG?GGT?ACC?TTA?CTT?TTT?TAT?TTT?TAG；

(3)nisRK基因PCR擴增、回收、與pGEM-T連接及轉化

以產Nisin乳酸乳球菌染色體DNA為模板，PCR獲得目的基因；采用凝膠回收試劑盒對PCR產物進行回 收；回收產物與克隆載體pGEM-T通過T4?DNA連接酶進行連接；連接產物轉化E.coli?JM109感受態細胞中， 在含有200μg/mL氨芐青霉素的培養基中篩選陽性克隆子；

(4)nisRK基因的鑒定

挑取陽性菌落接種于200μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37℃搖床培養過夜；次日收集菌體，小量 制備重組陽性質粒pGEM-T::nisRK；并對其進行PCR鑒定和1Xba?I/Kpn?I雙酶切鑒定；

b.乳酸菌單質粒Nisin誘導表達載體pW425N的構建

(1)nisRK基因和基礎載體pW425et的回收、連接及鑒定

將pGEM-T::nisRK和基礎質粒pW425et分別用Xba?I/Kpn?I雙酶切后，回收目的片段，采用T4DNA連接 酶進行連接；連接產物轉化E.coli?X13感受態細胞中，在含有200μg/mL紅霉素的LB培養基中篩選陽性克隆 子；小量制備重組質粒后，進行PCR鑒定和Xba?I/Kpn?I雙酶切鑒定；結果表明，成功組建了重組質粒 pW425et::nisRK；

(2)誘導型啟動子nisA基因的獲得、鑒定及pW425N的構建

根據GenBank登錄的nisA序列，采用Primer?5.0分子生物學軟件進行引物設計，上下游引物分別加入 EcoR?I和Sac?I酶切位點，每條引物全長24bp，由寶生物工程(大連)有限公司合成；引物序列如下：

上游引物P1：GGG?GAA?TTC?ATT?AAA?TTC?TGA?AGT

下游引物P2：GGG?GAG?CTC?TTA?TTT?GCT?TAC?GTG

以產Nisin乳酸乳球菌染色體DNA為模板，PCR獲得目的基因；采用凝膠回收試劑盒對PCR產物進行回 收；回收產物與pW425et::nisRK分別用EcoR?I/Sac?I進行雙酶切，將回收目的產物采用T4DNA連接酶進行 連接，再轉化E.coli?X13感受態細胞中，在含有200μg/mL紅霉素的LB培養基中篩選陽性克隆子；小量制備 重組質粒，對其進行PCR鑒定和EcoR?I/Sac?I雙酶切鑒定；結果表明，獲得的誘導型啟動子nisA與已知序 列同源性高達100％，并用其成功替換了原組成型啟動子P32，構建了乳酸菌單質粒Nisin誘導表達載體 pW425N。

2.權利要求1所述的乳酸菌單質粒Nisin誘導表達載體的使用方法，其方法是：

a、綠色熒光蛋白gfp基因的獲得及鑒定

根據GenBank登錄的綠色熒光蛋白gfp基因開放閱讀框序列GI：1674491，采用Primer?5.0分子生物學軟件 進行引物設計，上下游引物分別加入Sac?II和Cla?I酶切位點，每條引物全長24bp，由寶生物工程(大連)有 限公司合成；引物序列如下：

上游引物P1：GTT?CCG?CGG?ATG?ACC?ATG?ATT?ACG

下游引物P2：GGG?ATC?GAT?TTA?TTT?GTA?GAG?CTC

以含有綠色熒光蛋白gfp基因的質粒為模板，PCR獲得目的基因；采用凝膠回收試劑盒對PCR產物進行 回收；回收產物與克隆載體pMD18-T連接后轉化E.coli?JM109感受態細胞中，在含有200μg/mL氨芐青霉素 的LB培養基中篩選陽性克隆子；小量制備重組質粒pMD18-T::gfp，并對其進行PCR鑒定、Sac?II/Cla?I雙酶 切鑒定和測序鑒定；結果表明，成功獲得了綠色熒光蛋白gfp基因，與已知序列同源性高達100％；

b、重組表達載體pW425N::gfp的構建及鑒定

將pMD18-T::gfp和表達載體pW425N分別用Sac?II/Cla?I進行雙酶切，回收目的片段，采用T4DNA連接 酶進行連接，連接產物電轉化分離自豬腸道的乳酸桿菌感受態細胞中，在含有400μg/mL紅霉素的MRS培 養基中篩選陽性克隆子；小量制備重組表達載體pW425N::gfp并對其進行PCR鑒定和Sac?II/Cla?I雙酶切鑒 定；

c、Nisin誘導表達載體對綠色熒光蛋白誘導表達功能的測定

(1)確定豬源乳酸桿菌對Nisin耐受濃度RC和最小抑菌濃度MIC

挑取豬源乳酸桿菌單個菌落接種于新鮮含400μg/mL紅霉素的MRS培養基中，37℃恒溫厭氧培養至 菌液OD₆₀₀值為0.6～0.8時，取菌液按1∶100比例分別接種于含有不同濃度Nisin，10ng/mL、20ng/mL、 30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL的MRS培養基中；37℃恒溫厭氧培養24h后測定菌液OD₆₀₀值，以確定重組乳酸桿菌對Nisin的耐受濃度和最小抑菌濃度；

(2)確定添加Nisin對gfp基因誘導表達時程

將陽性重組菌接種于50mL的MRS培養基中，37℃恒溫厭氧培養至菌液OD₆₀₀值為0.6～0.8時，添加 10ng/mL?Nisin進行誘導表達；菌液OD₆₀₀值為0.6～0.8時，記為誘導0h，添加Nisin后，每隔1h取菌液 2mL，連取7h；最后將上述收集的菌液用MRS調OD₆₀₀值為0.6～0.8，4℃，4000r/min，離心10min， 沉淀用無菌生理鹽水清洗三次，最后重懸于3mL生理鹽水中；采用熒光分光光度計在激發光460nm波長 下測定樣品509nm波長下的相對熒光強度，確定最適誘導表達時間為3h；

(3)確定gfp基因誘導表達所需Nisin的最佳濃度

將陽性重組菌接種于50mL的MRS培養基中，37℃恒溫厭氧培養至菌液OD₆₀₀值為0.6～0.8時，向 培養基中添加Nisin，使終濃度分別為10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、 40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL；誘導表達后，分別取不同組樣品3mL，將收集 的菌液用MRS調OD₆₀₀值為0.6～0.8，4℃，4000r/min，離心10min，沉淀用無菌生理鹽水清洗三次， 最后重懸于3mL生理鹽水中；采用熒光分光光度計在激發光460nm波長下測定樣品509nm波長下的相 對熒光強度，確定最佳誘導表達所需的Nisin濃度為30ng/mL；

(4)SDS-PAGE電泳分析

將陽性重組乳酸桿菌接種于50mL的MRS培養基中，37℃培養至菌液OD₆₀₀值為0.6～0.8時添加Nisin誘 導目的基因表達；菌液OD₆₀₀值為0.6～0.8時，記為誘導0h，添加Nisin后，每隔1h取菌液1.5mL，連取6h； 最后將上述收集的菌液調OD₆₀₀值為0.6～0.8，4℃，12000r/min，離心5min后棄上清，加入50μL一餾水、 45μL上樣緩沖液、5μL二硫蘇糖醇，沸水煮10min后上樣進行SDS-PAGE電泳；電泳結束后，采用考馬斯 亮藍進行染色，經成像儀觀察后，成功獲得了27kDa的綠色熒光蛋白，與預期大小相符；

d、重組乳酸桿菌穩定性檢測

將重組乳酸桿菌在含有400μg/mL紅霉素的MRS培養基中傳至50代，提取重組質粒pW425N::gfp，對 其進行酶切鑒定和PCR鑒定；同時，取菌液100μL，10倍稀釋后分別作革蘭氏染色和熒光顯微鏡觀察；結 果表明，所構建的載體在傳至50代后仍能在乳酸菌中穩定地存在并表達綠色熒光蛋白。