[發明專利]隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 200810050956.7
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101353690A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 張西臣;李建華;李巍;宮鵬濤;張國才;楊舉;李淑紅
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明涉及隱孢子蟲病的診斷和檢測技術，更確切地說是提供了一種隱孢子蟲屬特異性及微小隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒及檢測方法，屬于寄生蟲檢測技術領域。

背景技術

隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲所引起的一種危害嚴重的人獸共患原蟲病，可造成哺乳動物尤其是反芻動物以及人的嚴重腹瀉。目前已經命名隱孢子蟲有27種，能感染人的隱孢子蟲有多種，其中以微小隱孢子蟲的感染最為常見，微小隱孢子蟲宿主范圍廣泛且危害嚴重，多感染人、家畜等哺乳動物，因此是隱孢子蟲屬中危害最大的隱孢子蟲種。

隱孢子蟲病的診斷方法主要有病原學診斷、免疫學診斷及分子生物學診斷三大類。病學學診斷多通過糞便顯微鏡檢及改良的抗酸染色法檢查，此法費時費力且檢出率低下。免疫學診斷有間接血凝試驗(IHA)、免疫熒光試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、單克隆抗體(McAb)等方法，然這些免疫學方法特異性和敏感性也較低。因此，開發一種特異靈敏的隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種的檢測方法已經是迫在眉睫。

發明內容

本發明提供一種隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異的PCR檢測試劑盒，用于隱孢子蟲病及微小隱孢子蟲種的鑒別診斷。

本發明還提供了該試劑盒的檢測方法。

本發明隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒，包括以下部分：

(1)DNA裂解液：含不同濃度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；

其中，濃度配比為：NaCl?100mM、Tris-HCl(pH7.5)20Mm、EDTA25Mm、SDS?2％(w/v)和蛋白酶K0.1μg/μl；

(2)PCR反應液：終濃度各100-300μM的4種dNTPs，終濃度各10-100pmol/μl的引物CF、CR、HF和HR，1.5-4.5mM的Mg²⁺濃度；Taq酶按每個PCR反應(20μl)含2.0U加入，反應液中不含Taq酶；

(3)隱孢子蟲屬和微小隱孢子蟲種特異性引物：

屬特異性診斷引物：CF：5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’

??????????????????CR：5’-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’

種特異性診斷引物：HF：5′-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3′

??????????????????HR：5′-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3

(4)陽性對照：陽性對照為微小隱孢子蟲基因組DNA，比較PCR產物以及監測PCR操作過程是否正確。

本發明的試劑盒還可以含有瓊脂糖(Agarose)、溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶，其濃度優選為溴化乙錠10μg/μl；溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶5U/μl。也還可以含有PCR反應管。

本發明所述的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1)樣本的預處理：取樣本用水混勻過篩，先過60目，再過100目篩，濾液反復離心沉淀三次，沉淀即為備用樣本；

2)樣本DNA的提取：

(1)將上述沉淀轉移到1.5ml離心管中，加入1ml裂解液，在液氮和65℃水浴中反復凍融三次；

(2)將凍融后的樣品加入5-6μl(20mg/ml)蛋白酶K，使其終濃度為100μg/ml。混勻后在65℃水浴中浸泡2h；

(3)用酚∶氯仿∶異戊醇(24∶25∶1)進行抽提兩次，7000r/min離心十分鐘；

3)、PCR擴增：

(1)準備待檢樣品數+2的PCR反應管，管內包括PCR液、Taq酶等，蓋緊蓋子，在渦旋器上混勻備用；

(2)將陰性和陽性對照分別加入標記好的管中，然后把樣品依次加入并標記好，置于PCR儀中。PCR條件為：95℃預變性5min、94℃變性30s、60℃退火40s、72℃延伸30s，共30個循環，后72℃延伸10min；

4)、PCR產物觀察：

稱取瓊脂糖，用電泳液混勻后(0.8％-1.0％)在微波爐中加熱三分鐘。等膠冷卻后在加樣孔中分別加樣，100V電壓下電泳10分鐘，之后在紫外燈下觀察實驗結果，如果出現同時存在424bp和223bp擴增條帶就證明是微小隱孢子蟲感染，如果只有223bp條帶就證明是其它種的隱孢子蟲感染。

試驗例1

試劑盒的組成