[發明專利]人血清中血管生成素檢測方法及其應用

無效

• 申請號: 200810050672.8
• 申請日: 2008-04-30
• 公開（公告）號: CN101271115A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發明（設計）人: 王麗;邱田
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 長春市東師專利事務所
• 代理人: 劉延軍;趙軍

1、雙抗體夾心ELISA法檢測血清中血管生成素的方法，其特征是：

1)重組人血管生成素蛋白的表達、純化

利用RT-PCR方法從培養的人黑色素瘤細胞系A375中擴增得到了人血管生成素cDNA片段，測序正確后克隆入表達載體pET28-a(+)中并轉化于E.coli?BL21宿主菌中，經IPTG誘導，表達了N端融合6個組氨酸標簽6His-tag的血管生成素融合蛋白，利用6His-tag與過渡態金屬離子Ni²⁺高親合力結合的性質，經鎳柱純化，獲得了高純度的血管生成素融合蛋白；

2)人血管生成素單克隆抗體和多克隆抗體的制備

按常規方法制備人血管生成素單克隆抗體和多克隆抗體；

3)雙抗體夾心ELISA法檢測血清中血管生成素

用人血管生成素單克隆抗體和多克隆抗體進行夾心ELISA檢測人血清中的血管生成素：

(1)ELISA實驗條件的確定

棋盤滴定選擇優化的ELISA實驗條件，以血管生成素單抗說明書建議濃度2μg/mL包被96孔酶標板，包被液為0.05M?pH?9.6碳酸鹽緩沖液，0.16g?Na₂CO₃，0.29g?NaHCO₃溶于100ml水中，濕盒中4℃溫育過夜；次日，用含0.05％的Tween20，pH7.4PBST緩沖液洗滌3次，每次3分鐘，再用PBS液洗滌兩次，每次2分鐘；每孔加入100μl含5％脫脂奶粉的PBS緩沖液進行封閉，置于濕盒中37℃溫育1h，按如上方法洗滌；按倍比稀釋縱列加血清，第一列稀釋倍數為5倍，此后各列稀釋倍數依次為10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120、10240，每孔加入50μl置于濕盒中，37℃溫育1h，洗滌；按倍比稀釋橫排加兔抗人血管生成素多克隆抗體，第一行稀釋倍數為100，此后各行稀釋倍數依次為200、400、800、1600、3200、6400，每孔加入50μl置于濕盒中，37℃溫育1h，洗滌；加入1∶5000倍稀釋的辣根過氧化物酶HRP標記的山羊抗小鼠IgG，每孔50μl，37℃溫育1h，洗滌；加入底物TMB，置室溫顯色12分鐘，用2mol/L?H₂SO4溶液終止反應；在酶標儀上檢測OD_450/620的吸光值；不同稀釋度的血清與不同稀釋度的多抗進行組合，確定最適條件為血清稀釋倍數為10倍，多抗的稀釋倍數為800倍；

以棋盤滴定法確定的ELISA最適條件對數百例健康人血清進行檢測，選取臨界值質控血清，以血管生成素系數來描述cut-off值，確定實驗的cut-off值為1.4，血管生成素系數＝樣本血清OD_450nm/620nm/質控血清OD_450nm/620nm；

(2)患者血清血管生成素含量的測定

利用雙抗體夾心ELISA檢測血清血管生成素水平，操作同上，檢測時每塊板上均加入陽性對照血清、陰性對照血清、臨界值質控血清，結果以血管生成素系數表示，如果血管生成素系數大于或等于cut-off值1.4，則為血管生成素陽性，所有樣本的檢測均為平行雙孔，結果取兩孔平均值；。