[發明專利]人血清中血管生成素檢測方法及其應用

無效

• 申請號: 200810050672.8
• 申請日: 2008-04-30
• 公開（公告）號: CN101271115A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發明（設計）人: 王麗;邱田
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 長春市東師專利事務所
• 代理人: 劉延軍;趙軍

技術領域

本發明屬于生物醫學工程中的免疫學技術領域，具體涉及人血清中血管生成素檢測方法及其應用。

背景技術

腫瘤的發生、發展和轉移與新生血管的形成密切相關，血管生成的過程受很多重要的血管生成因子和受體調控。一些可溶性的血管生成因子能夠在血漿中檢測到，目前已分離和純化了20多種血管生成因子和相關因子，如血管內皮生長因子(vascular?endothelial?growthfactor，VEGF)、血管生成素(angiogenin)、堿性成纖維生長因子(basic?fibroblast?growth?factor，bFGF)等，它們通過各種機制降解血管基底膜和周圍細胞外基質，促進內皮細胞分裂、游走和增殖，誘導宿主毛細血管新生。大量的研究表明腫瘤患者血清中血管生成因子的表達水平與腫瘤的級別，入侵程度，腫瘤地位，遠距離轉移和臨床階段都是正相關的。在眾多的血管生成因子中，血管生成素是迄今為止惟一一個基于其促進血管新生能力而被發現和分離純化的血管生成因子，其重要性越來越受到重視，已逐漸成為研究的熱點之一。時至今日，人們通過對血管生成素結構、性質及功能等的大量研究，已初步了解了其促進血管生成作用的機理，并在腫瘤檢測、治療和預后等方面取得了一定的成果。

血管生成素在許多腫瘤中都有表達，血清中的血管生成素表達水平上升。血管生成素與腫瘤的快速生長、浸潤、轉移、分期及預后均有密切關系。人們通過對腫瘤生長過程中血管生成素表達水平的大量研究發現，血管生成素與腫瘤的快速生長、浸潤、轉移、分期及預后均有密切關系。在乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、胃癌、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴管瘤以及黑色素瘤等多種癌癥患者的血清中血管生成素的水平都高于健康個體，而且這種水平的高低與癌癥的惡性化程度相關。建立人血清中血管生成素檢測方法，有利于開發腫瘤臨床診斷試劑。

發明內容

本發明的目的是確立一種能夠用于血管生成素檢測的有效方法。

本發明的方案：

按常規方法表達并純化人血管生成素蛋白，制備人血管生成素抗體，為血管生成素血清檢測提供實驗基礎。分別采用競爭ELISA法和雙抗體夾心ELISA法檢測血清中的血管生成素，采用了兔抗人血管生成素多克隆抗體進行競爭ELISA，鼠抗人血管生成素單克隆抗體和兔抗人血管生成素多克隆抗體進行夾心ELISA，檢測人血清中的血管生成素，棋盤滴定法優化ELISA實驗條件，確定最適血清稀釋倍數和抗原抗體稀釋倍數。聯合兩種檢測方法，分析人血清血管生成素的檢出率。

本發明是采用競爭ELISA法和雙抗體夾心ELISA法檢測血清中血管生成素含量，并對結果進行分析，聯合兩種檢測方法，可以相互補充，提高了人血清血管生成素的檢出率。

具體實施方式

一、雙抗體夾心ELISA法檢測血清中血管生成素

1)重組人血管生成素蛋白的表達、純化

利用RT-PCR方法從培養的人黑色素瘤細胞系A375中擴增得到了人血管生成素cDNA片段，測序正確后克隆入表達載體pET28-a(+)中并轉化于E.coli?BL21宿主菌中.經IPTG誘導，表達了N端融合6個組氨酸標簽(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag與過渡態金屬離子Ni²⁺高親合力結合的性質，經鎳柱純化，獲得了高純度的血管生成素融合蛋白。

2)人血管生成素單克隆抗體和多克隆抗體的制備

按常規方法制備人血管生成素單克隆抗體和多克隆抗體。

3)雙抗體夾心ELISA法檢測血清中血管生成素

我們采用了人血管生成素單克隆抗體和多克隆抗體進行夾心ELISA檢測人血清中的血管生成素。

(1)ELISA實驗條件的確定