[發(fā)明專利]三種甘薯病毒的多重RT－PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810049503.2
• 申請日: 2008-04-07
• 公開（公告）號: CN101250594A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發(fā)明（設計）人: 張振臣;張業(yè)輝;張德勝;蔣士君;喬奇;王永江;秦艷紅
• 申請（專利權）人: 河南省農業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳大通

一、技術領域：

本發(fā)明涉及生物工程技術領域，特別是涉及三種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測方法。

二、背景技術：

甘薯潛隱病毒(Sweet?potato?latent?virus，SPLV)、甘薯G病毒(Sweet?PotatoVirus?G，SPVG)和甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet?potato?feathery?mottle?virus，SPFMV)是危害甘薯的主要病毒。三種病毒都屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，常常混合侵染，造成甘薯產(chǎn)量降低，品質變劣和種性退化，對甘薯生產(chǎn)造成嚴重危害。對甘薯病毒病目前尚無特別有效的化學防治方法，利用莖尖分生組織培養(yǎng)，培育脫毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。在培育脫毒甘薯的過程中，需要對甘薯莖尖苗進行病毒檢測，因此，建立甘薯病毒高效的檢測技術是培育脫毒甘薯的前提和基礎。目前用于甘薯病毒檢測的常用方法是酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術和PCR技術，由于ELISA技術的靈敏度較低，而且SPLV、SPVG和SPFMV三種病毒的抗體之間常有交互反應，不能對三種病毒進行特異性檢測。而利用單一的RT-PCR檢測方法對多種病毒進行檢測時，工作量大，效率低。

申請?zhí)枮?00610019481.6的專利申請公開了一種一次復合PCR反應同時檢測馬鈴薯病毒和類病毒的方法，該方法通過一次復合PCR，可同時檢測四種馬鈴薯病毒和一種馬鈴薯類病毒。但是，該方法并不適用于甘薯病毒的檢測。

三、發(fā)明內容：

本發(fā)明要解決的技術問題：提供了一種在一次PCR反應中可同時檢測三種甘薯病毒的方法，為甘薯病毒的特異性檢測提供了一種簡便、高效和低成本的方法。

本發(fā)明的技術方案是：

三種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測方法，其步驟包括：

(1)分別合成甘薯潛隱病毒引物SEQ?1、SEQ?2，甘薯G病毒引物SEQ?3、SEQ?4和甘薯羽狀斑駁病毒引物SEQ?5、SEQ?6；

其中，SEQ?1：5′-CTTCAGTGACGTTGCTGAAGC-3′，

SEQ?2：5′-TGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′，

SEQ?3：5′-CCAAATATCAATGGTGATTGGGT-3′，

SEQ?4：5′-CCACGCATTCCAAGTAGTGTGTGT-3′，

SEQ?5：5′-GCACCAATGGCAAATGGAAGAATAG-3′，

SEQ?6：5′-GAGGTTATGTATATTCCTTGTAAC-3′；

(2)提取樣品中病毒的總RNA，作為PCR模板，進行反轉錄；

(3)將所述SEQ?1、SEQ?3、SEQ5引物等體積混合形成上游引物混合物，將所述SEQ?2、SEQ?4、SEQ?6引物等體積混合形成下游引物混合物，然后將所述上、下游引物混合物置于PCR反應體系中，以反轉錄產(chǎn)物作為模板，進行PCR擴增；

(4)用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

所述反轉錄反應體系為10μl，包括1μl?10×RT?buffer、2μl濃度為25mM的MgCl₂、1μl濃度各為10mM的dNTP混合物、0.5μl濃度為2.5μM的Oligo?dT引物、10U?RNase抑制劑、2.5UAMV反轉錄酶和4.75μl病毒的總RNA；反轉錄反應程序為：42℃30min，99℃5min，5℃5min。

所述PCR反應體系為50μl，包括10μl?5×PCR?buffer、2.5U?Taq酶、0.5μl濃度各為10mM的dNTP混合物、1μl上游混合引物、1μl下游混合引物，其中每種引物濃度均為10μM，用5μl反轉錄產(chǎn)物作模板，用DEPC-H₂O補足至50μl。

所述PCR擴增反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明建立了可同時檢測SPLV、SPVG和SPFMV三種病毒的多重RT-PCR檢測技術，即在一次PCR反應中同時檢測上述三種病毒，有效地提高了檢測效率，降低了生產(chǎn)成本。

(2)本發(fā)明可應用于脫毒甘薯的培育過程中，通過對三種主要甘薯病毒的快速高效檢測，可以確保脫毒甘薯的質量和增產(chǎn)效果。

(3)本發(fā)明可對甘薯病毒種類進行特異性鑒定，可應用于甘薯種薯調運以及病害調查等過程中。

四、附圖說明：

圖1：引物濃度對實驗結果的影響