[發(fā)明專利]三種甘薯病毒的多重RT－PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810049503.2
• 申請日: 2008-04-07
• 公開（公告）號: CN101250594A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發(fā)明（設計）人: 張振臣;張業(yè)輝;張德勝;蔣士君;喬奇;王永江;秦艷紅
• 申請（專利權）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳大通

1.三種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，

(1)分別合成甘薯潛隱病毒引物SEQ1、SEQ2，甘薯G病毒引物SEQ3、SEQ4和甘薯羽狀斑駁病毒引物SEQ5、SEQ6；

其中，SEQ1：5′-CTTCAGTGACGTTGCTGAAGC-3′，

??????SEQ2：5′-TGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′，

??????SEQ3：5′-CCAAATATCAATGGTGATTGGGT-3′，

??????SEQ4：5′-CCACGCATTCCAAGTAGTGTGTGT-3′，

??????SEQ5：5′-GCACCAATGGCAAATGGAAGAATAG-3′，

??????SEQ6：5′-GAGGTTATGTATATTCCTTGTAAC-3′；

(2)提取感病牽牛葉片的總RNA，作為PCR模板，進行反轉錄；

(3)將所述SEQ1、SEQ3、SEQ5引物等體積混合形成上游引物混合物，將所述SEQ2、SEQ4、SEQ6引物等體積混合形成下游引物混合物，然后將所述上、下游引物混合物置于PCR反應體系中，以反轉錄產(chǎn)物作為模板，進行PCR擴增；

(4)用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2.根據(jù)權利要求1所述的三種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，所述反轉錄的反應體系為10μl，包括1μl?10×RT?buffer、2μl濃度為25mM的MgCl₂、1μl濃度各為10mM的dNTP混合物、0.5μl濃度為2.5μM的Oligo?dT引物、10U?RNase抑制劑、2.5UAMV反轉錄酶和4.75μl病毒的總RNA；反轉錄反應程序為：42℃30min，99℃5min，5℃5min。

3.根據(jù)權利要求1所述的三種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR反應體系為50μl，包括10μl?5×PCR?buffer、2.5U?Taq酶、0.5μl濃度各為10mM的dNTP混合物、1μl上游混合引物、1μl下游混合引物，其中每種引物濃度均為10μM，用5μl反轉錄產(chǎn)物作模板，用DEPC-H₂O補足至50μl。

4.根據(jù)權利要求1所述的三種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。