[發明專利]一種基于抗生素篩選轉基因水稻種子的方法

無效

• 申請號: 200810047085.3
• 申請日: 2008-03-18
• 公開（公告）號: CN101241123A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 李陽;李陽生
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于水稻轉基因技術領域，更具體涉及一種基于抗生素篩選轉基因種子的方法，尤其適合于水稻種子篩選。

技術背景：

目前水稻轉基因種子篩選陽性植株，是用PCR的方法，進一步的鑒定是通過Southern?blot。PCR的篩選方法其流程是：1，用水稻種子發苗待長到有6片葉大小時，大約要40天；2，剪取0.2克左右的葉片。用CTAB方法提取基因組；3，PCR驗證；4，電泳檢測。用這種方法篩選鑒定周期較長，因為要等到苗子長到一定大小才可以取材，因為并不知道這些苗子是陽性的還是陰性的，要栽種很多的苗子，所以要耗費大量的精力，之后的提取DNA，PCR，電泳也是一系列繁瑣的工作，費時，費力，成本高！

發明內容：

本發明的目的是在于提供了一種利用抗生素篩選轉基因水稻種子的方法，方法簡便，篩選結果準確，能獲得外源目的基因高效表達的植株，效率高，成本低廉，節約了資源。

一種利用抗生素篩選轉基因水稻種子及其基因型判定的方法，其步驟是：

1，利用抗生素篩選轉基因水稻種子：

A)最佳篩選抗生素濃度確定：設定抗生素選擇梯度(對于潮霉素：0，100，200，400，600，800，1000ul/l原始濃度2.5ug/ul；對于卡那霉素：0，100，200，400，600，800，1000mg/l)，將未轉基因的受體種子在其中萌發，幼芽生長剛好完全被抑制的抗生素濃度即為最佳篩選抗生素濃度。

B)篩選條件：在2.5mm左右深的、適當濃度(根據A)確定的最適合濃度(濃度為卡那霉素400mg/l和潮霉素600ul/l)的抗生素溶液中鋪墊兩層大小適中的濾紙，在其上均勻鋪撒所需數量的(種子密度小于1個/平方厘米)飽滿的轉基因水稻種子；陰性對照是未進行基因轉化的受體種子，陽性表型對照為未加抗生素的受體種子。

C)培育條件：保持培養體系密閉，密閉空間要有一定的高度(6～10cm)的條件下26-30度暗培養5天。

D)結果判定：結果將出現三種情況的種子：①陽性表型：芽體正常，根生長旺盛，根長超過2cm；②陰性表型：芽體和根生長受到典型抑制，根長小于0.5cm；③萌發不正常的種子，沒有發芽，或者芽體不正常，此種表型是種子本身發芽能力不好所致，與轉基因陰性陽性沒有關系。

2，轉基因植株的基因型純合雜合的判定方法

該判定方法是建立在第一步上，以抗生素為基礎篩選轉基因陽性種子的方法的基礎上進行統計分析。

判斷方法1：

A)設置對照：用未轉基因的受體種子做一個加入抗生素的陰性對照和一個未加入抗生素的陽性對照。

B)按照《以抗生素為基礎篩選轉基因陽性種子的方法》所闡述的為基礎，如果想判定某一轉基因株系的基因型，只要在進行此株系的種子篩選時設置一個不加抗生素的對照即可簡單的判斷出來。

對照如表所示：