[發明專利]納他霉素高產菌株的選育及納他霉素高效發酵提取純化方法

無效

• 申請號: 200810047019.6
• 申請日: 2008-03-11
• 公開（公告）號: CN101307299A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 江正兵;宋慧婷;馬立新
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/62;C07H17/08;C07H1/06;C12R1/465
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發明涉及一株高產納他霉素菌株的篩選、遺傳誘變及利用該高產菌株進行納他霉素發酵和提取純化的工藝方法，屬于工業微生物技術領域。

背景技術

納他霉素(Natamycin)也稱游鏈霉素(Pimaricin)，是一種重要的多烯類抗菌素，該抗菌素是一種很強的抗真菌試劑，由于它能夠專一性的抑制酵母菌和霉菌，阻止絲狀真菌中黃曲霉毒素的形成。1955年Struyk等人從南非Natal州Pietermaritzburg鎮附近的土壤中分離得到納塔爾鏈霉菌Streptomyces?natalensis，并從中首次分離得到了納他霉素。現在可由

Streptomyces?natalensis和StrePtomyces?chatanoogensis等鏈霉菌發酵經微生物發酵生產。

納他霉素外觀白色(或奶油色)，為無色、無味的結晶粉末，分子量為665.73，結構式如下圖。納他霉素是一種兩性物質，分子中有一個堿性基團和一個酸性基團，等電點為6.5，熔點為280℃。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，難溶于大部分有機溶劑。室溫下在水中的溶解度為30～100mg/L。在pH值高于9或低于3時，其溶解度會有所提高，在大多數食品的pH范圍內非常穩定。納他霉素具有一定的抗熱處理能力，在干燥狀態下相對穩定，能耐受短暫高溫(100℃)。

納他霉素結構式

Natamycin作為食品防腐劑、添加劑廣泛應用于乳制品生產、果蔬汁生產、肉制品加工、焙烤類食品以及飼料加工等許多領域，因其抗真菌也廣泛應用于醫藥領域，具有良好的應用前景。限制Natamycin廣泛應用的主要問題是其較高的生產成本和昂貴的價格。

目前，已經有納他霉素發酵生產的相關專利(公開號：CN1070688A；CN1071460A；CN1072959A；1891834A)和提取純化專利(公開號：CN101062934A；CN1515678A；CN1891709A)。所公開的專利中，納他霉素的發酵水平均在10g/L以下，而且整個發酵過程中需要進行pH值的控制，這樣使工藝過程麻煩，且得率和純化率都不高。

發明內容

本發明的目的是提出一種高產納他霉素生產菌株的選育及其發酵培養生產工藝和提取純化工藝方法，從而實現納他霉素的低成本、高產量、高品質的生產。

一、納他霉素高產菌株的選育

以本實驗室篩選并保藏的鏈霉菌HBJ016為出發菌株，用UV誘變結合原生質體融合的基因組重排技術進行遺傳育種。UV誘變過程中，鏈霉菌孢子懸液濃度為10⁶～10⁸個/ml，20W紫外燈20～30cm距離照射，采用多次間隔照射(UV照射1～2分鐘后，在黑暗條件下室溫孵育2～3分鐘，再次UV照射1～2分鐘，如此反復3～6次)的方法提高其突變頻率，在高致死率的情況下(致死率控制在80％～90％之間)，篩選高濃度鏈霉素抗性突變株，該方法可以有效提高篩選得到正突變的幾率。將UV誘變得到的不同突變株采用常規原生質體融合及雙親滅活原生質體融合技術，進行基因組重排，經過多輪篩選得到一株納他霉素高產菌株Streptomyces?gilvosporeus?HBJ591(保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號：CCTCCNo.M208028)。經多次重復實驗，該突變菌株搖瓶發酵的產量均保持在10.6g/L左右的水平，表現出較好的遺傳穩定性，在10L～100L發酵罐中進行放大發酵，產量達到15.5g/L的高產水平。

HBJ591菌株的菌學特性：

a、形態特征：在瓊脂培養基上生長，氣生菌絲發達，微褐色或淺褐色，邊緣白色。

b、生理生化特征：能液化明膠，水解淀粉，不產類黑色素，最適生長溫度28℃～30℃。

二、納他霉素發酵工藝

下面是以HBJ591納他霉素高產菌株Streptomyces?gilvosporeus為菌種的發酵工藝，可以在10L～100L發酵罐中放大或縮小發酵體積，發酵周期在96～160小時之間，發酵產量在13～15.5g/L的水平，與搖瓶發酵相比提高了約4g/L。該工藝與其他已公開的納他霉素發酵工藝相比顯著的特點就是，從種子培養到發酵的整個過程，無需進行pH值的控制，避免了酸堿的使用，大大簡化了發酵工藝，降低了環保壓力。該工藝適用于100L～100，000L發酵罐的工藝放大。具體工藝如下：

一)種子培養

A.種子培養基配方

蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，葡萄糖15g/L，其余為水。