[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)金葡菌腸毒素A的免疫膠體金試紙條及制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810046935.8
• 申請(qǐng)日: 2008-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101271110A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡章立;張仁利;甄茵
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳大學(xué);深圳市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/558
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

1.?一種檢測(cè)金葡萄腸毒素A的免疫膠體金試紙條，它包括樣品墊(3)、檢測(cè)線(xiàn)(5)和質(zhì)控線(xiàn)(6)，其特征在于：在PVC底板(1)的兩端分別設(shè)有樣品墊(3)和吸水墊(7)，在PVC底板(1)中部設(shè)有硝酸纖維膜檢測(cè)層(2)，在硝酸纖維膜檢測(cè)層(2)與樣品墊(3)交界處設(shè)有包被金標(biāo)標(biāo)記抗SEA抗體的金標(biāo)墊(4)，在金標(biāo)墊(4)一端設(shè)置樣品墊(3)，另一端設(shè)置在硝酸纖維膜檢測(cè)層(2)上，在與金標(biāo)墊(4)延續(xù)的硝酸纖維膜檢測(cè)層(2)上設(shè)有檢測(cè)線(xiàn)(5)和質(zhì)控線(xiàn)(6)，在檢測(cè)線(xiàn)(5)和質(zhì)控線(xiàn)(6)上分別包被有抗SEA抗體和羊抗鼠IgG。

2.?一種用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)金葡萄腸毒素A的免疫膠體金試紙條的制備方法，它包括下列步驟：

A、SEA的制備：

通過(guò)PCR法篩選出產(chǎn)腸毒素A金黃色葡萄球菌，提取產(chǎn)腸毒素A金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pGEM-T?Easy克隆載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，含SEA正確序列的重組質(zhì)粒經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pET28a表達(dá)載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒pET-SED轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，30℃?0.5mM?IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜，離心收集菌體，在冰水上進(jìn)行超聲波破菌，離心，分別收集上清液和沉淀，進(jìn)行電泳分析，安裝XK26柱子，進(jìn)行清洗、裝鎳、平衡程序，上清液經(jīng)過(guò)0.45μm濾器過(guò)濾后開(kāi)始上樣，用含40mM咪唑的Washing?buffer清洗Ni離子層析柱，用250mM咪唑的Elution?buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫液，測(cè)定蛋白濃度，冰凍干燥呈干粉保存；

B、抗SEA特異性抗體的制備：

通過(guò)Protein?G親和層析法純化抗SEA抗體，首先是將抗血清置于Protein?G親和層析柱柱吸附瓊脂的表面；其次是用10倍柱體積的1×Washing-Binding?Buffer洗吸附柱；第三是用4倍柱體積的1×Elution?Buffer洗脫，得到SEA特異性抗體；

C、金黃色葡萄球菌腸毒素A膠體金檢測(cè)試紙條的制備：

a、空白膠體金的制備：

采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在燒瓶加入1000ml雙蒸水和10ml?1％氯金酸，加熱至沸騰，加入20ml?1％檸檬酸鈉，繼續(xù)煮沸約10-20分鐘，直到液體呈亮紅色，將燒杯置于室溫，水浴中冷卻，冷藏保存；

b、膠體金標(biāo)記抗體的制備：

取空白膠體金，用0.1M?K₂CO₃將pH值調(diào)至7.4，在磁力攪拌下滴入稀釋好的抗體，每ml膠體金加入20μg抗體，繼續(xù)攪拌30分鐘，離心，吸除上清，用金標(biāo)抗體保存液重懸松散的膠體金沉淀；

c、金標(biāo)墊的制備：

調(diào)試二維噴動(dòng)儀，將標(biāo)記好膠體金的抗SEA抗體均勻地噴在玻璃纖維膜上，噴液量為0.6微升/厘米，37℃烘干過(guò)夜，封袋備用；

d、包被膜的制備：

調(diào)試二維噴動(dòng)儀，將稀釋好的抗SEA抗體均勻地噴在硝酸纖維膜上，得到檢測(cè)線(xiàn)；將稀釋好的羊抗鼠二抗均勻地噴在硝酸纖維膜上，得到質(zhì)控線(xiàn)，噴液量均為0.6微升/厘米，37℃烘干過(guò)夜，封袋備用。