[發(fā)明專利]一種檢測(cè)金葡菌腸毒素A的免疫膠體金試紙條及制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810046935.8
• 申請(qǐng)日: 2008-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101271110A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡章立;張仁利;甄茵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳大學(xué);深圳市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): G01N33/558
• 分類號(hào): G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素A的免疫膠體金試紙條，同時(shí)還涉及免疫膠體金試紙條的制備方法，可實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌腸毒素A的快速診斷，適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、食物中毒和院內(nèi)感染的快速診斷和應(yīng)急處理。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)，簡(jiǎn)稱金葡菌，是常見(jiàn)的食物中毒和醫(yī)院污染的主要病原菌之一，廣泛分布于皮膚、粘膜，特別是鳥(niǎo)及哺乳動(dòng)物的鼻咽部。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體的抵抗力下降或皮膚粘膜破損時(shí)，病菌便可乘虛而入，引起畜禽各種化膿性疾病。近年來(lái)，金葡菌感染在畜牧業(yè)中流行嚴(yán)重，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

金葡菌在水分、蛋白質(zhì)和淀粉較多的食品中極易繁殖并分泌多種體外毒性蛋白，其中金葡菌腸毒素(Staphylococcal?enterotoxins，SEs)是引起細(xì)菌性食物中毒及腸胃炎的重要致病因子，也是生物戰(zhàn)劑中的主要毒素。人體如果食入被腸毒素污染的食物，很快(2～6小時(shí))就會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹部疼痛、腹瀉等典型的食物中毒癥狀，重者，尤其是年老患者會(huì)發(fā)生休克樣癥狀乃至死亡。

金葡菌腸毒素是一組分子量小(26kD～30kD)、結(jié)構(gòu)相似、血清型不同的可溶性蛋白質(zhì)，對(duì)熱穩(wěn)定，在100℃、30min的情況下不能被滅活。根據(jù)血清型已鑒定的SEs有SEA～SEE，由它們引起的食物中毒占金葡菌食物中毒的95％，其中又以SEA居多(77.8％)，D型次之(37.5％)。近年來(lái)，許多新的腸毒素血清型SEG～SER也相繼被分離。

由金葡菌腸毒素引起的食物中毒一直是世界性的衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)，該事件居細(xì)菌性食物中毒的第二位，占33％。加拿大占45％，匈牙利、芬蘭等歐洲國(guó)家占50％以上，我國(guó)每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多，全國(guó)各地均有報(bào)道。在目前條件下，要完全避免腸毒素對(duì)食品及飼料的污染非常困難。除了在糧食收獲、儲(chǔ)存、加工各個(gè)環(huán)節(jié)科學(xué)作業(yè)、注意防霉去毒外，唯一有效的辦法是加強(qiáng)對(duì)食品及飼料等的監(jiān)控檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染的食品和飼料，并立即剔除，防止腸毒素超標(biāo)污染的食品進(jìn)入人類的食物鏈。

自上世紀(jì)60年代利用免疫學(xué)方法作為金葡菌腸毒素中毒的診斷手段以來(lái)，免疫血清學(xué)技術(shù)這方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，現(xiàn)行金葡菌腸毒素的檢測(cè)方法主要依靠免疫學(xué)技術(shù)，例如反向間接血凝法(RPHA)、反向被動(dòng)乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(RPLA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。

RPHA是將各型腸毒素抗血清吸附或偶聯(lián)于綿羊、雞和人紅血球表面，再加人被檢的含有相應(yīng)腸毒素的標(biāo)本，出現(xiàn)血細(xì)胞凝集即為陽(yáng)性。該試驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速，檢出靈敏度高，可達(dá)1ng/ml，1～3小時(shí)即可判定結(jié)果。RPLA方法的原理同RPHA，不同之處是將抗體吸附于乳膠顆粒上。RPHA和RPLA敏感性較高，但操作較復(fù)雜，需要細(xì)菌純培養(yǎng)和制備腸毒素，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，從培養(yǎng)到診斷結(jié)果需要一個(gè)星期，因此不能實(shí)現(xiàn)快速診斷，且非特異性反應(yīng)和假陽(yáng)性較多。

近十幾年來(lái)，ELISA開(kāi)始廣泛用于腸毒素的檢測(cè)。此法是利用酶反應(yīng)測(cè)定抗體抗原特異性反應(yīng)方法，敏感、快速、簡(jiǎn)便，應(yīng)用較廣。EIISA的缺陷是：(1)需要專門(mén)的儀器設(shè)備如酶標(biāo)儀來(lái)配合使用；(2)操作人員需要經(jīng)過(guò)專門(mén)培訓(xùn)；(3)操作過(guò)程相對(duì)較為復(fù)雜，檢測(cè)所需時(shí)間比較長(zhǎng)；(4)檢測(cè)過(guò)程局限在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，不適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)樣品的分析。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，尤其是中國(guó)加入WTO后，農(nóng)副產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的擴(kuò)大，發(fā)展并推廣簡(jiǎn)便、快速、靈敏、適用于樣品實(shí)地檢測(cè)的方法勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測(cè)金葡菌腸毒素A的免疫膠體金試紙條，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)快速，靈敏度高，成本低廉，安全簡(jiǎn)便。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種免疫膠體金試紙條的制備方法，它包括SEA、抗SEA特異性抗體的制備、SEA免疫膠體金檢測(cè)試紙條的制備。該試紙條操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，全過(guò)程只需10分鐘，不受環(huán)境條件的干擾，特異性好，且檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)限為1ng/ml。本發(fā)明適用于海關(guān)、醫(yī)院、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)食品或臨床標(biāo)本中金黃色葡萄球菌腸毒素A的快速檢測(cè)。