[發(fā)明專利]一種三維高通量藥物篩選芯片及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810046929.2
• 申請(qǐng)日: 2008-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN101245311A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙興中;王曉明;張南剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué);湖北中醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢華旭知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所
• 代理人: 劉榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型的能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平高通量藥物生物活性篩選的三維聚二甲基硅氧烷-玻璃芯片及其制備方法，屬于微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，藥物篩選已成為當(dāng)前微流控芯片技術(shù)中最具潛力的應(yīng)用領(lǐng)域之一。單個(gè)細(xì)胞及胞內(nèi)微量物質(zhì)的分析與檢測(cè)已在微流控芯片中得到初步實(shí)現(xiàn)，但細(xì)胞水平的高通量藥物篩選仍然是微流控技術(shù)發(fā)展的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。而傳統(tǒng)的藥物篩選，主要在玻璃培養(yǎng)皿和九十六孔板中操作，工作量繁重，試劑和藥物消耗量大，篩藥周期漫長(zhǎng)，開發(fā)成本高昂。當(dāng)前，迫切需要開發(fā)出一種新型的藥物篩選平臺(tái)，來(lái)加快藥物篩選的進(jìn)度和中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。?

發(fā)明內(nèi)容

為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明中利用微機(jī)電加工和微塑膜技術(shù)創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)并制作出一種三維微溝道結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)-玻璃芯片，它在細(xì)胞水平的藥物篩選中，具有芯片微型化、高通量、低成本、試劑消耗小、試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠和操作流程簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。?

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的采用的技術(shù)方案是：一種三維高通量藥物篩選芯片，至少包括聚二甲基硅氧烷和玻璃載片，其特征是：第一層聚二甲基硅氧烷芯片上設(shè)有細(xì)胞注入和廢液輸出溝道；另一層聚二甲基硅氧烷芯片上設(shè)有藥物濃度梯度溝道和定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室以及細(xì)胞進(jìn)樣打孔處和廢液出口打孔處，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室與藥物濃度梯度溝道的出口溝道連接，且定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室通過(guò)溝道分別與細(xì)胞進(jìn)樣打孔處和廢液出口打孔處連接，，第一層聚二甲基硅氧烷芯片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道通過(guò)細(xì)胞進(jìn)樣打孔處和廢液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧烷芯片鍵合在一起，鍵合在一起的兩層聚二甲基硅氧烷芯片再與玻璃載片鍵合在一起。?

細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥物濃度梯度溝道為單向阻尼結(jié)構(gòu)或溝道內(nèi)設(shè)有微閥門。?

所述三維高通量藥物篩選芯片的制備方法包括以下步驟：?

(1)設(shè)計(jì)細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥物濃度梯度溝道的圖形，然后打印出膠片掩膜，溝道深度為50～100um，溝道寬度為100～3000μm，定量細(xì)胞腔室直徑在1000～3000μm之間；?

(2)在潔凈硅片上均勻涂甩上AZ50正型光刻膠；?

(3)將涂膠硅片先于70～100℃下烘烤固化；?

(4)將烘烤后的涂膠硅片與膠片掩膜平行對(duì)準(zhǔn)貼緊后，紫外充分曝光；?

(5)曝光充分后浸入顯影溶液，待顯影完全后，用去離子水沖洗干凈，再吹干，在涂膠硅片上制作出陽(yáng)模圖形；?

(6)重復(fù)步驟(1)～(5)，分別制備兩片出帶細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥物濃度梯度溝道布局的硅片-光刻膠陽(yáng)模；?

(7)將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物灌注到制得的兩片硅片-光刻陽(yáng)模上，待氣泡排盡后，烘焙2～3h，直至固化完全；?

(8)切割并剝離兩片含溝道的聚二甲基硅氧烷，打孔，等離子體處理后，第一層聚二甲基硅氧烷芯片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道通過(guò)細(xì)胞進(jìn)樣打孔處和廢液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧烷芯片對(duì)準(zhǔn)鍵合得雙層聚二甲基硅氧烷芯片；?

(9)將上述雙層聚二甲基硅氧烷芯片和玻璃載片等離子體處理后再鍵合在一起；?

(10)70～90℃烘焙1～2h后，即制作出含兩層微溝道結(jié)構(gòu)的三維高通量藥物篩選聚二甲基硅氧烷-玻璃芯片。?

為盡量減少溝道內(nèi)阻和穩(wěn)定流場(chǎng)分布，上述細(xì)胞注入和廢液輸出溝道為分叉結(jié)構(gòu)；藥物濃度梯度的溝道藥物濃度梯度溝道為逐級(jí)分叉結(jié)構(gòu)，在藥物和培養(yǎng)基的不同的注入流速下，形成一系列藥物濃度梯度分布。第一層聚二甲基硅氧烷芯片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道通過(guò)細(xì)胞進(jìn)樣打孔處和廢液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧烷芯片對(duì)準(zhǔn)鍵合得雙層聚二甲基硅氧烷芯片，雙層聚二甲基硅氧烷芯片的兩層溝道通過(guò)數(shù)個(gè)微孔貫通，溝道呈現(xiàn)出三維分布；為了準(zhǔn)確控制流體在溝道內(nèi)的流向，在溝道的局部位置設(shè)計(jì)為單向阻尼結(jié)構(gòu)或溝道內(nèi)設(shè)有微閥門，以阻止細(xì)胞懸浮液進(jìn)入濃度梯度溝道。?

上述的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道為分叉結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞注入和廢液輸出溝道深度和寬度分別為50～100μm和300～3000μm，藥物濃度梯度溝道深度和寬度分別為50～100μm和100～1000μm。?

為了保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確性，細(xì)胞定量培養(yǎng)微腔室實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的定量培養(yǎng)，向各個(gè)腔室中注滿均勻分布細(xì)胞懸浮液，由于等體積和等濃度條件，使得每個(gè)培養(yǎng)腔室中的細(xì)胞數(shù)目近似相等。為了使試驗(yàn)數(shù)據(jù)能在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室構(gòu)成三行平行試驗(yàn)組微腔室、兩行空白對(duì)照組微腔室和一行陽(yáng)性對(duì)照組微腔室。?

本發(fā)明的具有如下優(yōu)點(diǎn)：?