[發明專利]可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母及其制備方法

無效

• 申請號: 200810046911.2
• 申請日: 2008-02-20
• 公開（公告）號: CN101240251A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 肖偉;戴和平;張敏;張曉華
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/52;C12N15/81;C12Q1/04;C12Q1/34;C12R1/645
• 代理公司: 武漢荊楚聯合知識產權代理有限公司
• 代理人: 王健

技術領域：

本發明涉及面包酵母，是將可用于檢測環境致癌物的面包酵母通過遺傳基因改造，提高通透性，使其對環境致癌物檢測的范圍更廣、靈敏度更高。

背景技術：

環境中有害的工業化學物質是誘發癌癥的原因之一，這些有害的工業化學物質可以損傷DNA，誘使DNA突變從而導致癌癥的發生。這類能與細胞遺傳物質產生反應，可直接或經代謝活化生成親電子物質，改變DNA的結構和功能，以增殖方式誘發腫瘤的化學物稱為遺傳毒性致癌物(genotoxic?carcinogen)。這類致癌物具有明顯的致突變作用，可引起細胞突變或染色體損傷，具有較大的危害性。因此，監測環境中的這些遺傳毒性致癌物，對于控制和減少其對人類健康的損害具有重要意義。

美國科學家B.N.Ames等建立的鼠沙門氏菌回復突變試驗(亦稱Ames試驗)已被世界各國廣泛應用于遺傳毒性致癌物的檢測。該試驗是以原核生物為模式生物，其在染色體的結構和代謝形式等很多方面均不同于真核生物，即鼠沙門氏菌回復突變試驗的結果不能直接應用于人類，其應用具有一定的局限性。因此，要檢測對人類健康有損害的遺傳毒性致癌物，需要以真核生物為模式生物的監測系統。

面包酵母RNR3-lacZ檢測系統就是以真核生物面包酵母(S.cerevisiae)為模式生物，以面包酵母RNR3基因的啟動子與lacZ(β-半乳糖苷酶)的融合體作為檢測元件，使基因表達水平可以通過測定酶學顏色反應來監控和定量。RNR3是面包酵母核苷酸還原酶的大亞基，而核苷酸還原酶則是催化DNA合成所需的脫氧核苷酸產生的限速酶。RNR3的mRNA轉錄水平在通常條件下較低，卻有較高的誘導表達水平。它的誘導表達只與DNA損傷有關，而與通常的細胞脅迫和生長周期無關。由于不論何種形式的DNA損傷的修復都需要脫氧核苷酸進行DNA合成，從理論上說，任何可損傷DNA的化學物都有可能誘導RNR3的表達。研究表明，一些被Ames試驗顯陰性的，但對哺乳動物和人有致癌效應的化學物，可以用亞致死量誘導RNR3-lacZ的表達。因此面包酵母RNR3-lacZ檢測系統有希望發展為可替代Ames試驗的新型真核單細胞環境遺傳毒性致癌物檢測系統。

面包酵母是一種簡單真核生物，單細胞，遺傳改造操作簡單，培養簡便快速且環境友好。面包酵母細胞具有細胞壁，可維持細胞的一定形態、增強細胞的機械強度，并且與細胞的通透性有關。環境中的遺傳毒性致癌物通常以很低濃度存在，由于面包酵母細胞壁的通透性障礙，限制了環境遺傳毒性致癌物在面包酵母細胞內的積累，從而降低了系統的檢測靈敏度；分子量大的化學物甚至不能自由通過面包酵母細胞壁，無法被該系統檢測到。

基因敲除是自80年代末發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。由于面包酵母的全基因測序已經完成，所以可以根據目的基因的序列，設計同源基因序列，對目的基因進行敲除。

發明內容：

本發明的目的是提供一種可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母，該高通透性面包酵母通過基因敲除技術改造現有面包酵母的細胞壁，提高其通透性，從而提高該系統檢測遺傳毒性致癌物的范圍及靈敏度。本發明的另一目的是提供可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母的制備方法。

面包酵母細胞壁的厚度為25～70nm，重量約占細胞干重的25％，主要成分為葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質和幾丁質，另有少量脂質。它們在細胞壁上自外至內的分布次序是甘露聚糖、蛋白質、葡聚糖。葡聚糖(glucan)位于細胞壁的內層，是賦予面包酵母細胞機械強度的主要物質。甘露聚糖(mannan)是甘露糖分子以α-(1→6)相連的分枝狀聚合物，位于細胞壁外側，呈網狀，若把它去除后，細胞仍維持正常形態。且更為重要的是，外層甘露聚糖決定細胞壁的通透性。CWP1基因和CWP2基因編碼面包酵母細胞壁的甘露糖蛋白，通過基因敲除技術，敲除CWP1基因和CWP2基因，可抑制甘露糖蛋白的合成，從而提高面包酵母細胞壁的通透性。

本發明的可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母，其特征在于，該高通透性面包酵母為缺失CWP1?CWP2雙基因的面包酵母。

為了制備可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母，本發明采用如下技術方案：