[發明專利]可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母及其制備方法

無效

• 申請號: 200810046911.2
• 申請日: 2008-02-20
• 公開（公告）號: CN101240251A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 肖偉;戴和平;張敏;張曉華
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/52;C12N15/81;C12Q1/04;C12Q1/34;C12R1/645
• 代理公司: 武漢荊楚聯合知識產權代理有限公司
• 代理人: 王健

1、可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母，其特征在于，該高通透性面包酵母為缺失CWP1?CWP2雙基因的面包酵母。

2、實現權利要求1所述的可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母的制備方法。其特征在于，該方法按下列步驟進行：

一、提取面包酵母基因組DNA

1a、取少量面包酵母(Saccharomyces.cerevisiae，單倍體BY4741，MATa?his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)，接種于5毫升的YPD培養液中，30℃，200轉/分鐘培養16小時，得到面包酵母菌液；

其中：YPD培養液的配方為：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，余者為水；

1b、取面包酵母菌液1.5毫升，用4000轉/分鐘離心2分鐘，沉淀物懸于200微升提取緩沖液中；

其中：提取緩沖液的配方為：曲拉通X-100?2％，十二烷基磺酸鈉1％，氯化鈉0.1摩爾，乙二胺四乙酸1毫摩爾，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽10毫摩爾，余者為水，pH?8.0；

1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震蕩3分鐘后，以12000轉/分鐘離心10分鐘，吸取上層液體；

1d、加入所取液體體積2倍的無水乙醇，在-20℃靜置30分鐘，以12000轉/分鐘離心15分鐘，去上清，取沉淀物；

1e、將沉淀物溶解于20微升無菌水中，即為面包酵母基因組DNA溶液；

二、基因敲除組件的構建

2a、將含有XhoI內切酶位點的上游引物CWP1-1?5′-GTACCGAATCGTAGCTCGAGG-3′和含有SphI內切酶位點的下游引物CWP1-25′-GGGAATGTGAGAGCTGCATGC-3′以面包酵母基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到CWP1基因；

其中：PCR的條件為：94℃?5分鐘；94℃?45秒，52℃?1分鐘，72℃?1分鐘，30個循環；72℃?10分鐘；4℃；

2b、將CWP1基因克隆到pGEM-T載體上，用StyI內切酶切下一段0.62kb的片斷；

2c、用BamHI內切酶從YDp-L上切下一段含有LEU2基因的1.6-kb片斷，用它替換步驟2b的CWP1基因上用StyI內切酶切下的一段0.62kb的片斷；

2d、經步驟2c替換的pGEM-T載體，再用XhoI-SphI酶切，得到cwp1Δ::LEU2基因敲除組件；

三、將cwp1Δ::LEU2基因敲除組件轉入CWP2單基因敲除面包酵母，篩選得到CWP1?CWP2雙基因敲除面包酵母；

3a、將CWP2單基因敲除面包酵母接種到2毫升YPD培養液，30℃，200轉/分鐘下振蕩培養16小時；

其中：YPD培養液的配方為：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，余者為水；

3b、再加入YPD培養液3毫升，30℃，200轉/分鐘，培養4小時，得到CWP2單基因敲除面包酵母菌液；

3c、取1.5毫升CWP2單基因敲除面包酵母菌液，以2500轉/分鐘離心2分鐘，取沉淀物；

3d、將沉淀物懸于100毫摩/升的400微升醋酸鋰中，以2500轉/分鐘離心2分鐘，取沉淀物；

3e、將沉淀物懸于100毫摩/升的100微升醋酸鋰中；

3f、將2.0毫克/毫升的鮭魚精單鏈DNA?2微升煮沸5分鐘，連同步驟2d得到的cwp1Δ::LEU2基因敲除組件0.1～1微克一起加入，室溫，放置5分鐘；

3g、再加入280微升50％的聚乙二醇4000；

3h、振蕩反應管直至混勻，30℃靜置保溫30分鐘；

3i、加入39微升二甲基亞砜，42℃水浴中熱激5分鐘；

3j、4000轉/分鐘離心2分鐘，取沉淀物，無菌水洗一次；

3k、4000轉/分鐘離心2分鐘，取沉淀物，懸于100微升無菌水中，涂SD-Leu選擇性平板，30℃培養箱中培養3天，生長出單克隆子；

其中：SD-Leu選擇性平板的配方為：酵母氮源無氨基酸無硫酸銨0.17％，硫酸銨0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.2％，色氨酸1％，組氨酸1％，尿嘧啶1％，賴氨酸1％，瓊脂粉2％，余者為水；

3l、挑取單克隆子接種于5毫升SD-Leu選擇性培養液中，在30℃下以200轉/分鐘振蕩培養16小時；

其中：SD-Leu選擇性培養液的配方為：酵母氮源無氨基酸無硫酸銨0.17％，硫酸銨0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.2％，色氨酸1％，組氨酸1％，尿嘧啶1％，賴氨酸1％，余者為水；

3m、4000轉/分鐘離心2分鐘，取沉淀物，提取單克隆子基因組DNA；

3n、以單克隆子基因組DNA為模板，用上游引物CWP1-1和下游引物CWP1-2進行PCR擴增；

3o、CWP1?CWP2雙基因敲除面包酵母基因組PCR擴增產物的分子量應明顯大于野生型面包酵母基因組PCR擴增所得產物，以此為檢驗標準，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，篩選得到CWP1CWP2雙基因敲除面包酵母；

四、CWP1?CWP2雙基因敲除面包酵母RNR3-lacZ系統的構建

將攜帶URA3基因作為選擇性標記的RNR3-LacZ基因融合質粒pZZ2，通過醋酸鋰轉化方法轉入到CWP1?CWP2雙基因敲除面包酵母菌中，并通過SD-Ura選擇性平板篩選陽性菌株，即為可檢測環境遺傳毒性致癌物的高通透性酵母；

其中：SD-Ura選擇性平板的配方為：酵母氮源無氨基酸無硫酸銨0.17％，硫酸銨0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.2％，色氨酸1％，組氨酸1％，亮氨酸1％，賴氨酸1％，瓊脂粉2％，余者為水；

五、將可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母用于遺傳毒性致癌物的檢測，通過β-半乳糖苷酶活力測定，將可檢測環境遺傳毒性致癌物的高通透性酵母用于遺傳毒性致癌物的檢測

5a、將可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母接種于SD-Ura選擇性培養液中，30℃，200轉/分鐘下振蕩培養16小時，得到可用于檢測環境致癌物的高通透性面包酵母菌液；

5b、將步驟5a中得到的高通透性面包酵母菌液0.5毫升接種到2.5毫升SD-Ura選擇性培養液中，30℃，200轉/分鐘下振蕩培養至OD₆₀₀的值在0.15～0.20之間；

其中：SD-Ura選擇性培養液的配方為：酵母氮源無氨基酸無硫酸銨0.17％，硫酸銨0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤O.2％，色氨酸1％，組氨酸1％，亮氨酸1％，賴氨酸1％，余者為水；

5c、加入分子量為1526道爾頓的DNA損傷試劑腐草霉素，培養4小時；

5d、用分光光度計測定經DNA損傷試劑腐草霉素處理的面包酵母菌液的密度0D₆₀₀值；

5e、取2毫升經DNA損傷試劑腐草霉素處理的面包酵母菌液，2500轉/分鐘離心2分鐘，取沉淀物；

5f、將沉淀物懸于1毫升Z緩沖液中，加入0.1％十二烷基磺酸鈉50微升，50微升氯仿，高速渦旋10秒，使菌破裂；

其中：Z緩沖液的配方為：Na₂HPO₄?60毫摩爾，NaH₂PO₄?40毫摩爾，KCl?10毫摩爾，MgSO₄?1毫摩爾，2-巰基乙醇40毫摩爾，pH?7.0，余者為水；

5g、按如下方法測定β-半乳糖苷酶活力：加入4毫克/毫升的鄰硝基苯-β-D-硫代半乳糖苷200微升，在30℃下保溫20分鐘，

再加入1摩爾Na₂CO₃?500微升終止反應；

以3500轉/分鐘離心10分鐘，取上清，測定0D₄₂₀吸收值；

用下面的公式計算β-半乳糖苷酶活力：S_AB-gal＝(1000×OD₄₂₀)/(反應時間×菌液體積×OD₆₀₀)，其中：S_AB-gal表示β-半乳糖苷酶活力；

5h、按照以上方法平行測定未經DNA損傷試劑處理的面包酵母菌液β-半乳糖苷酶活力，兩者比值大于二為陽性，且比值越大，說明檢測靈敏度越高。