[發明專利]一種源于魚皮的ACE抑制肽的制備方法

無效

• 申請號: 200810046745.6
• 申請日: 2008-01-21
• 公開（公告）號: CN101240312A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 劉成梅;梁漢縈;劉偉;梁瑞紅;涂宗財
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/14
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種源于魚皮的ACE抑制肽的制備方法。

背景技術

血管緊張素轉化酶(ACE)對血壓調節起著重要的作用，在人體的腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin?system，RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(kallikrein-kinin?system，KKS)中，ACE以血管緊張素I和舒緩激肽為底物，導致血管收縮，引起血壓升高。

血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)是現今治療高血壓與心力衰竭的主要有效藥物，化學合成的ACE抑制劑在臨床使用時暴露了諸多缺陷，如：作用時間短，血壓易反彈，對人體內多個部位造成損傷等。源于食物蛋白質的ACE抑制劑-血管緊張素轉換酶抑制肽因其食用安全性高，無毒副作用等優點引起了人們的廣泛關注。

目前已有人從沙丁魚、金槍魚、小麥、玉米、大豆、酸奶、清酒等食品中分離出具有ACE抑制活性的降壓肽并顯示出了良好的應用前景。

我國是世界最大的羅非魚生產國，隨著鮮魚片、凍魚片和條凍魚出口量的逐年上升，由此產生的大量魚皮等下腳料需要處理。這些下腳料若不加以有效的利用，不僅會造成極大的浪費，而且還會造成環境的污染。目前，國外對魚類膠原蛋白的研究較為深入，有關魚皮膠原蛋白的研究也有不少報道，但是，對羅非魚魚皮膠原蛋白的有關研究，既不系統，也缺乏深度。

羅非魚魚皮含有豐富的膠原蛋白，如果能夠對其進行充分利用，通過酶法加工淡水魚膠原蛋白獲得抑制ACE的活性肽，對促進人們生活質量的提高將會收到很好的經濟效益與社會效益。

發明內容

本發明的目的是提供一種源于魚皮的ACE抑制肽的分離純化技術，獲得魚皮中具有降血壓活性的多肽片段。

本發明是這樣來實現的，其方法步驟為：

1、預處理：清洗后的魚皮經脫脂后，依次用0.1mol/L的鹽酸溶液和0.1mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡1hr。

2、水提：預處理后的魚皮經洗滌至中性后，在45℃條件下，用10倍體積的蒸餾水恒溫勻漿12hr后，抽濾提取上清液。

3、酶解：在一定條件下，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進行酶解，比較兩種酶的酶解效果，并確定最佳酶解條件。

4、滅酶：采用100℃，20min滅酶。

5、脫苦、脫色、脫味：分別采用活性炭和復合脫色劑(3g/L的活性炭酵母和環糊精等混合而成)對酶解液進行脫苦、脫色、脫味處理，比較兩種方法的效果。

6、過濾：酶解液經脫苦、脫色、脫味處理后，再經4000r/min離心過濾獲得清液。

7、離子交換：取一定體積的超濾液在常溫下以8倍柱體積/h的流速通過001*7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，收集流出液，再將脫陽離子后的水解液以8倍柱體積/h的流速通過201*7(717)強堿性I型陰離子交換樹脂，收集流出液。

8、濃縮：使用旋轉蒸發儀，濃縮溫度為50℃，蒸發溶液至粘稠狀。

9、超濾：選用中空纖維材料，超濾設備的工作壓力為28psi，膜滲透通量為9.98LHM，超濾處理時間為40min，進料溫度為29℃，料液pH值為6.7。

10、凝膠色譜：收集超濾液進入凝膠色譜進行進一步分離純化，分離介質為SephadexG-15，色譜柱(1.6×60cm)，柱層析條件：上樣量：1.5ml；流速：0.8ml/min；洗脫劑：蒸餾水；檢測波長：220nm。

11、測定ACE的抑制率：參照Nakamura等(1995)改進的方法，根據反應體系的大小、乙酸乙酯萃取量、離心時間等具體情況進行了一定研究和修改。分別測定每個組分峰的半數抑制濃度(IC₅₀)，即所測樣品對ACE抑制率達50％時所對應的樣品濃度。

據表1將各試劑加入到試管中，在37℃水浴中反應30min，反應結束后馬上加入1moL/LHCI以終止反應(樣品c需提前加入HCl)，靜止5min后，于各試管中加入乙酸乙酯(冷)2.0mL，旋渦混合2min后離心10min(4000r/min)，吸取1.5mL乙酸乙酯于另一試管中，放入烘箱中，120℃揮發溶劑30min，冷卻后加入去離子水3mL，旋渦混合30sec靜止15min后在228nm下測定其吸光值。

表1ACE體外檢測抑制率的方法(ul)