[發明專利]重組長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法

無效

• 申請號: 200810043597.2
• 申請日: 2008-07-04
• 公開（公告）號: CN101372705A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發明（設計）人: 朱化星;蔡麗君;王英明;丁劍鋒
• 申請（專利權）人: 上海欣百諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/14;C12R1/84
• 代理公司: 上海光華專利事務所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及重組蛋白，具體涉及重組長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法。

背景技術

糖尿病是一種多病因的代謝性疾病，已成為現代社會嚴重危害人類健康與生命的主要疾 病。根據世界衛生組織(WHO)提供的數據，發達國家糖尿病患病率已高達5％-10％，在我國 則為3％左右；到2030年，全世界糖尿病患者人數將比2000年翻一番。其中2型糖尿病患 者人數目前約占所有糖尿病患者人數的90％以上。

胰高血糖素樣肽-1(glucagon.like?peptide.1GLP—1)可以與GLP-1受體相結合， 通過多種作用控制血糖，包括刺激胰島素分泌、同時抑制胰高血糖素和胃排空，但是不會 產生低血糖，對II型糖尿病的治療具有較好的效果。天然胰高血糖素樣肽-1在體內很快被 DPP-IV降解，半衰期只有2-3分鐘，在給藥上具有很大的困難。

腸促胰島素類似物(exendin-4)最初由毒蜥屬動物唾液中分離，是由基因exendin-4 表達產生，可激活人體內GLP-1受體，可以通過促進胰島素分泌和細胞再生、抑制食物攝 入而降低血糖。但它不是DIP-IV的底物，因而具有較長的半衰期和較強的生物活性。 exendin-4注射給藥后，能夠模擬調控機體胰島素的激素在體內發揮作用，從而達到控制血 糖的效果。exendin-4一天注射兩次，優點在于不需要根據糖化血紅蛋白(HbAlc)或血糖 水平來調整劑量，在早餐和晚餐前給予固定劑量即可，從而減少患者頻繁監測血糖的不便。 HGS公司的Albugon，它是GLP-1和人血清白蛋白(human?serum?albumin，HSA)的融合體， 它在猴子體內的半衰期為3天，目前已進入臨床II期。

人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質，構成血液中的蛋白質總量的一半。白 蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩定的惰性性質是維 持血壓的一個重要因素。人血清白蛋白是一種球狀非糖基化的，分子量為65Kd的蛋白質。 人血清白蛋白的基因位于4號染色體上，有16961個堿基對，分為15個間隔區，經RNA加 工拼接后形成的mRNA可編碼一個具有585個氨基酸的蛋白質。這一蛋白在經過高爾基體的 轉化加工，去除分泌信號而分泌到細胞外。人血清白蛋白有35個半胱氨酸，構成17個二 硫鍵的單體(Brown?JR，The?structure，functional?and?application?of?human?albumin， Pergamon，NY1977)。人血清白蛋白具有多種多態形及30種不同的遺傳分子(Weikamp， CR，human?genomic?Annual，37：219-226，1973)。人血清白蛋白分子的三維結構已經由 X光衍射法測定(Carter，Science，244，1195-1198，1989)。人血清白蛋白是血液種的 主要成分，在人體內含量為每升血液含40克，半衰期壽命為14-20天。綜上所述，人血清 白蛋白具有極大的優勢使之可抵御生物體內酶的作用，并可使治療性蛋白質以較高的劑量 使用。

目前用于臨床的人血清白蛋白均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達白蛋白 (rHSA)的生產專利已經公開，EP330451和EP361991。

發明內容

本發明的目的在于提供一種長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法。

本發明中的長效胰高血糖素樣肽類似物為將exendin-4和人血清白蛋白通過基因工程 的方法融合在一起的融合蛋白，融合蛋白分子既保持exendin-4蛋白的生物學功能，又含 有HSA穩定的惰性性質，極大的延長了exendin-4的半衰期。在臨床使用中可減少注射給 藥次數，減輕患者的痛苦，提高療效并降低醫療費用。

以往不同基因融合表達中，在考慮兩個蛋白生物學活性上，兩個基因之間往往需要連接 肽(linker)連接，而連接肽在臨床治療中可能造成高的免疫原性。本發明在研究exendin-4 蛋白和人血清白蛋白構象和活性中心后，充分利用兩個不同蛋白N端和C端的序列特征， 使兩個基因直接相連融合表達，避免了免疫原性的擔憂，同時保留了exendin-4的降糖活 性。本發明在獲得了表達長效胰高血糖素樣肽類似物的基因工程菌的基礎上，又對其發酵 和純化工藝進行了選擇及優化，在保證產物活性的基礎上，進一步提高了蛋白表達效率及 純化產物得率。