[發明專利]重組長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法

無效

• 申請號: 200810043597.2
• 申請日: 2008-07-04
• 公開（公告）號: CN101372705A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發明（設計）人: 朱化星;蔡麗君;王英明;丁劍鋒
• 申請（專利權）人: 上海欣百諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/14;C12R1/84
• 代理公司: 上海光華專利事務所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，包括下列步驟：

a)在發酵罐中接種表達長效胰高血糖素樣肽類似物的基因工程畢赤酵母菌種；

b)發酵罐發酵培養；

c)發酵液離心并收集上清；

d)發酵液上清液中長效人胰高血糖素樣肽類似物的分離純化:發酵液上清經藍色染 料親和層析進行粗純化，再經疏水層析中純化，再經離子交換層析精純化后獲得 純度大于95％的產物。

2.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，所述長效胰高 血糖素樣肽類似物是由exendin-4與人血清白蛋白直接連接獲得的多肽，exendin-4與 人血清白蛋白之間沒有連接肽。

3.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，所述步驟a為 將基因工程菌菌種以YPD培養基搖瓶培養14小時—18小時后接種發酵罐。

4.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，步驟b中，所 述發酵罐培養的條件為：采用基礎鹽培養基，控制溶解氧大于30％，溫度為30℃，pH6.0， 培養16-20小時后，補加甘油溶液，再培養4-6小時；甘油培養階段結束后，以向發酵 罐中補加甲醇，發酵約70個小時后結束發酵。

5.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，步驟b中，所 述基礎鹽培養基中加有6ml/L培養基的微量元素添加劑PTM1。

6.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，步驟b中，所 述甘油溶液為體積百分比50％的甘油溶液，且甘油溶液中含有12ml/L的PTM1。

7.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，步驟b中，所 補加甲醇的過程為：先控制補加甲醇的速度為3.6ml/小時/升培養基，其中甲醇中含有 12ml/L的PTM1，而后逐步提高甲醇補料速度到10.8ml/小時/升培養基，并以此速度補 加甲醇70小時后結束發酵。

8.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，步驟d中，所 述發酵液上清經藍色染料親和層析進行粗純化的步驟為：發酵上清液pH到7.0，上樣到 經20mM?pH為7.0的磷酸鹽、500mM?NaCl緩沖液平衡的藍色染料(Blue?Sephroase)親 和層析柱，上樣完畢后先用20mM?pH為7.0的磷酸鹽、128mM?KSCN緩沖液沖洗去未結合 的物質，再用20mM?pH為7.0的磷酸鹽、230mM?KSCN緩沖液沖洗脫結合在柱上的融合蛋 白，以紫外280nM吸收檢測，收集蛋白峰。

9.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，步驟d中，所 述疏水層析中純化的步驟為：收集的蛋白溶液，調節硫酸銨的終濃度為0.46M，調節pH 到7.0，此溶液上樣到經20mM的磷酸鹽加0.5M硫酸銨pH為7.0緩沖液平衡的Phenyl High?Performance層析柱，上樣完畢后先用20mM的磷酸鹽加0.3M硫酸銨pH為7.0緩 沖液沖洗去未結合的物質，使紫外280nm吸收的降回到基線，再用20mM磷酸鹽加上0.1M 硫酸銨pH7.0的溶液洗脫結合在柱上的融合蛋白。

10.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的制備方法，其特征在于，步驟d中，所 述離子交換層析精純化的步驟為：收集的蛋白溶液調節pH到5.0，并用水稀釋到電導率 小于3ms/cm，此溶液上樣到經20mM的醋酸鈉pH為5.0緩沖液平衡的CM?FF層析柱，上 樣完畢后先用80mM的醋酸鈉pH為6.5緩沖液緩慢洗脫，收集pH為6.2時的目標峰。