[發明專利]肝芽干細胞及其制備方法和用途

無效

• 申請號: 200810042682.7
• 申請日: 2008-09-09
• 公開（公告）號: CN101363010A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: 胡以平;蘇娟
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/54;A61K48/00;A61P1/16
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁振英

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及肝芽干細胞，及其制備方法和用途。

背景技術

近年來干細胞生物學得到了迅猛的發展。所謂干細胞，是指那些處于分化過程之中，具有分裂增殖能力，可自我更新，有多向分化潛能，即能分化產生一種以上“專業”細胞的原始細胞。干細胞依其分化潛能的大小可分為：①胚胎干細胞，即具有分化為機體任何一種組織器官潛能的細胞，如囊胚內細胞團細胞。②成體干細胞，即具有自我更新能力，但通常只能分化為相應(或相鄰)組織器官組成的“專業”細胞，它是存在于成熟個體各種組織器官中的干細胞，如造血干細胞、神經干細胞、肌肉干細胞、角膜干細胞、胰腺干細胞、皮膚干細胞、肝臟干細胞等。在成體干細胞向終末成熟細胞分化的進程中，其分化潛能進一步限定，從而產生相應的祖細胞。

肝干/祖細胞的分離培養及其深入研究對于肝臟發育、肝臟腫瘤和肝臟再生的發生機理以及多種肝臟疾病的防治都具有十分重要的價值。一般意義上的肝干/祖細胞是指具有旺盛的增殖能力，并可以分化為成熟肝細胞和膽管上皮細胞的肝臟原始細胞。由于肝干細胞在肝臟中存在的數量極少，再加上其分離培養的技術條件又十分特別等因素的緣故，目前成功培養的肝干/祖細胞系是十分有限的。而在成功培養的這些肝干/祖細胞系中，它們則主要來自大鼠或小鼠。

對于人的肝干細胞的研究則相對少得多。目前僅見有來源于人成體肝臟(Herrera?MB等，2006)，或晚期胚胎肝臟的干細胞(Dan?YY等，2006；Malhi?H等，2002)，而尚未見有來源于早期胚胎肝臟的干細胞。肝原基于人胚發育的第4周開始出現，第6周肝臟開始造血。大概90％的成體肝臟結構在胚胎發育的第8周可見。如果能從早期人胚肝芽組織中分離得到多潛能的干細胞，將為肝干細胞生物學的研究提供一個理想的細胞模型，也有可能為各種因素所致肝臟疾病的細胞治療、藥物的篩選、組織工程等多個領域的研究提供一種理想的細胞來源。

發明內容

本發明的目的是提供一種從人早期胚胎肝芽組織中分離培養多潛能干細胞的方法，本發明的另一目的是提供根據上述方法制得的肝芽干細胞及其應用。

本發明的一種從人胚肝芽組織中分離培養肝芽干細胞的方法，由以下步驟組成的：

A、原代培養物的建立：

取胎齡4.5至6周的流產人胚胎，以PBS充分洗滌后在解剖顯微鏡下分離出完整的胚胎肝臟，置于96孔板內以0.05％?Trypsin/EDTA消化約5分鐘，然后加入改良IF培養液終止消化，靜置后取懸液，置于鋪有0.2％明膠的培養皿內，37℃、5％?CO₂、95％濕度條件培養；待3-4小時細胞貼壁后換液，以后隔天換液，每次均以PBS洗滌2-3次；

改良IF培養液是以IMDM培養基：HAM?F12培養基＝1：1為基礎培養基，添加2.5％胎牛血清、5μg/ml胰島素、20ng/ml表皮細胞生長因子、1％非必需氨基酸、1mM?GlutamaxTM和1％青/鏈霉素配制而成；

B、細胞傳代培養：

在原代培養物生長兩周以后，一種小三角形細胞出現優勢克隆樣生長，以無菌細胞刮去除其他形態的細胞，PBS充分洗滌后，用0.05％?Trypsin/EDTA消化至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養液終止消化，用吸管吹打成單細胞懸液，計數后以1×10⁴/cm²的密度接種至另一鋪有0.2％明膠的培養瓶/皿中繼續培養；每4～5天傳代一次；

C、培養細胞的凍存與復蘇：

a)細胞的消化與凍存：細胞長至約90％匯合時，PBS充分洗滌，用0.05％Trypsin/EDTA消化，至大部分細胞形態變圓，加入含有胎牛血清的培養基終止消化，用吸管吹打成單細胞懸液，1000r.p.m離心6分鐘，棄去上清液，以10⁷個細胞/ml的比例加入凍存液，充分混勻后置于凍存管中密封，先置于4℃?30-60分鐘，后置于-70℃?10-14小時，最后置于液氮罐中保存；

凍存液是以凍存原液和步驟A中配制的改良IF培養液各一份混勻而成，凍存原液是以改良IF培養液：胎牛血清：二甲亞砜＝3:1:1配制而成；

b)凍存細胞的復蘇：將凍存管從液氮罐中取出，置于37℃水浴箱中解凍；1000r.p.m離心6分鐘，棄去凍存液，置于鋪有0.2％明膠的培養皿中，加入改良IF培養液，37℃、5％?CO2、95％濕度條件培養。