[發(fā)明專利]肝芽干細(xì)胞及其制備方法和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810042682.7
• 申請日: 2008-09-09
• 公開（公告）號: CN101363010A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡以平;蘇娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/54;A61K48/00;A61P1/16
• 代理公司: 上海德昭知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 丁振英

1.一種從人胚肝芽組織中分離培養(yǎng)肝芽干細(xì)胞的方法，其特征在于該方法是由以下步驟組成的：

A、原代培養(yǎng)物的建立：

取胎齡4.5至6周的流產(chǎn)人胚胎，以PBS充分洗滌后在解剖顯微鏡下分離出完整的胚胎肝臟，置于96孔板內(nèi)以0.05％?Trypsin/EDTA消化約2-8分鐘，然后加入改良IF培養(yǎng)液終止消化，靜置后取懸液，置于鋪有0.2％明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5％?CO₂、95％濕度條件培養(yǎng)；待3-4小時(shí)細(xì)胞貼壁后換液，以后隔天換液，每次均以PBS洗滌2-3次；

改良IF培養(yǎng)液是以IMDM培養(yǎng)基：HAM?F12培養(yǎng)基＝1:1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2.5％胎牛血清、5μg/ml胰島素、20ng/ml表皮細(xì)胞生長因子、1％非必需氨基酸、1mM?GlutamaxTM和1％青/鏈霉素配制而成；

B、細(xì)胞傳代培養(yǎng)：

在原代培養(yǎng)物生長兩周以后，一種小三角形細(xì)胞出現(xiàn)優(yōu)勢克隆樣生長，以無菌細(xì)胞刮去除其他形態(tài)的細(xì)胞，PBS充分洗滌后，用0.05％Trypsin/EDTA消化至大部分細(xì)胞形態(tài)變圓，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以1×10⁴/cm²的密度接種至另一鋪有0.2％明膠的培養(yǎng)瓶/皿中繼續(xù)培養(yǎng)；每4～5天傳代一次；

C、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：

a)細(xì)胞的消化與凍存：細(xì)胞長至約90％匯合時(shí)，PBS充分洗滌，用0.05％Trypsin/EDTA消化，至大部分細(xì)胞形態(tài)變圓，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，1000r.p.m離心6分鐘，棄去上清液，以10⁷個(gè)細(xì)胞/ml的比例加入凍存液，充分混勻后置于凍存管中密封，先置于4℃30-60分鐘，后置于-70℃?10-14小時(shí)，最后置于液氮罐中保存；

凍存液是以凍存原液和步驟A中配制的改良IF培養(yǎng)液各一份混勻而成，凍存原液是以改良IF培養(yǎng)液:胎牛血清:二甲亞砜＝3:1:1配制而成；

b)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：將凍存管從液氮罐中取出，置于37℃水浴箱中解凍；1000r.p.m離心6分鐘，棄去凍存液，置于鋪有0.2％明膠的培養(yǎng)皿中，加入改良IF培養(yǎng)液，37℃、5％?CO2、95％濕度條件培養(yǎng)。

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的從人胚肝芽組織中分離培養(yǎng)肝芽干細(xì)胞的方法制得的肝芽干細(xì)胞。

3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的從人胚肝芽組織中分離培養(yǎng)肝芽干細(xì)胞的方法制得的肝芽干細(xì)胞，其特征在于該肝芽干細(xì)胞表達(dá)ALB、DPPIV、CYP1B1、CK19、GGT、c-Met、CK18、c-kit肝干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志，而不表達(dá)AFP、TAT和HNF；還表達(dá)SDF-1間質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)志；以及Oct4、Nanog多能性干細(xì)胞標(biāo)志；另外，該肝芽干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)，分化為內(nèi)胚層的成熟肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞和胰β細(xì)胞；外胚層的神經(jīng)細(xì)胞或中胚層的脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1的從人胚肝芽組織中分離培養(yǎng)肝芽干細(xì)胞的方法制得的肝芽干細(xì)胞作為臟器疾病的細(xì)胞治療及組織工程中細(xì)胞來源的應(yīng)用。