[發明專利]蚯蚓體腔細胞提取方法

無效

• 申請號: 200810042487.4
• 申請日: 2008-09-04
• 公開（公告）號: CN101343622A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 朱江;陸貽通
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種生物工程技術領域的細胞提取方法，具體地說，涉及的是一種蚯蚓體腔細胞提取方法。

背景技術

近年來，國內外已相繼開展了利用蚯蚓作為載體對可能造成土壤環境污染的化學物質進行測試，并根據這些化學物質對蚯蚓的毒害程度來評價其可能對環境的危害程度。也就是說利用蚯蚓作為土壤環境的一種指示生物。這方面的研究工作最早在上世紀四、五十年代就已開展，但只是在近二、三十年來隨著化學藥品在農業生態系統中的大量使用和城市及工業固體廢棄物的大量排放，土壤污染問題日益嚴重的情況下，蚯蚓生態毒理學研究工作才得到了較為普遍的重視和發展。1981年歐共體(EEC)做出規定：一種新的化學藥品登記進入市場之前要求具有針對于一種藻類，一種水蚤，一種高等植物，一種魚類，一種蚯蚓和一種有富積作用的物種的毒理試驗資料以及生物降解試驗資料。

蚯蚓的免疫系統由先天免疫屏障、細胞免疫和體液免疫三方面構成。蚯蚓的免疫防御體系由外部屏障結構和防止毒物入侵體內后進一步蔓延的內部免疫機制所組成，這種內部免疫機制有自然免疫和獲得性免疫兩種類型，包括細胞免疫和體液免疫。在蚯蚓的免疫防御體系中，屏障免疫和自然免疫起主要作用，而獲得性免疫不發達。目前已有報道蚯蚓免疫系統作為生物標志物對土壤中重金屬的污染的指示作用。

作為環節動物的典型代表，蚯蚓的體細胞依據形態學和來源分為兩類：(1)具有紅細胞的血液系統，這一部分與免疫關系不大。(2)體腔液中的細胞群，這些細胞都不同程度的與免疫過程有關，或者他們的代謝作用和分泌作用與體液免疫相關。此外，排除速度快、特異性小、記憶時間短是蚯蚓細胞免疫防衛的特點。蚯蚓的先天性免疫和適應性免疫的細胞功能主要是通過體腔細胞執行，因此，蚯蚓體腔細胞在細胞免疫中發揮著重要的作用。體腔細胞依染色方法和超微結構形態學、以及功能特性又分為阿米巴樣細胞和油細胞。

早期獲得蚯蚓體腔細胞主要是刺破蚯蚓體腔獲取細胞。目前多采用超聲波刺激，針刺，電壓刺激、酒精等刺激物的非損傷方法獲取蚯蚓的體腔細胞。隨著生物技術在細胞水平、亞細胞水平和分子水平的發展，以上各種方法提取的蚯蚓體腔細胞的數量和成活率已不能滿足目前對土壤污染快速檢測的需要。

纖維針結合超聲波刺激法提取的蚯蚓體腔細胞的數量多且成活率較目前已報道的其他方法高，可用于以蚯蚓體腔細胞為實驗對象的細胞流式技術的單細胞凝膠電泳實驗，滿足對土壤污染快速、靈敏、準確檢測的需要。

經對現有技術的文獻檢索發現，M.Hendawi等在《Ecotoxicology?andEnvironmental?Safety》(生態毒理與環境安全)(2004，59：17-22)上發表的“A?new?ultrasound?protocol?for?extrusion?of?coelomocyte?cells?from?theearthworm?Eisenia?fetida”(一種從赤子愛勝蚓提取體腔細胞的新的超聲波提取法)，該文中提出用超聲波提取法、乙醇法和電壓刺激法獲取蚯蚓體腔細胞，且該超聲波提取法獲得的蚯蚓體腔細胞數量明顯大于用乙醇法和電壓刺激法獲得的蚯蚓體腔細胞數量。具體方法為：將放置于緩沖液的蚯蚓多次(10次)暴露于超聲波2-3s。其不足在于：該方法雖然提取的蚯蚓體腔細胞數量較其他兩種方法多，但成活率僅為68.2±7.8％，不能滿足以蚯蚓體腔細胞為實驗對象的細胞流式技術和單細胞凝膠電泳實驗的需要。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種蚯蚓體腔細胞提取方法，即用纖維針結合超聲波刺激法提取的蚯蚓體腔細胞的技術，保證所提取的離體細胞的數量和成活率，為進一步開展蚯蚓細胞毒理實驗打下基礎。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟：

第一步，蚯蚓(Eisenia?andrei)清腸。

選用蚯蚓為安德愛勝蚓(Eisenia?andrei)，預養一段時間，然后選擇具有環帶的健壯成體，平均體重在300mg左右。蚯蚓清腸24小時后，用濃度為0.01molL^-1、pH7.2的PBS緩沖液反復沖洗干凈蚯蚓，加入3mL含有2.5mM乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)的PBS。

第二步，將纖維針細管插入蚯蚓體腔。

纖維針選用長1cm，內徑為0.5mm中空的纖維針細管。

第三步，用超聲波儀震蕩刺激蚯蚓。