[發明專利]監測土壤重金屬和多環芳烴復合污染的方法

無效

• 申請號: 200810042486.X
• 申請日: 2008-09-04
• 公開（公告）號: CN101344512A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 朱江;陸貽通
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N33/00
• 分類號: G01N33/00;C12Q1/02
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種環保技術領域的土壤污染監測方法，具體是一種監測土壤重金屬和多環芳烴復合污染的方法。

背景技術

土壤復合污染是當前進行環境保護科學研究前沿的一個熱點，但同時也是研究難點。由于復合污染的復雜性和實驗手段的局限性，對污染物復合污染缺少能進行定量表征的實驗方法。近年來已相繼開展了利用蚯蚓作為載體對可能造成土壤環境污染的化學物質進行測試，并根據這些化學物質對蚯蚓的毒害程度來評價其可能對環境的危害程度。隨著生物技術在細胞水平、亞細胞水平和分子水平的發展，對污染物毒性的檢測手段也隨之得到了提高，流式細胞儀(FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，與傳統的熒光鏡檢查相比，具有高通量、速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代最先進的細胞定量分析技術。

利用Annexin-V和PI雙染色法，用流式細胞儀準確檢測出蚯蚓體腔細胞成活率及質膜的早期變化。根據Annexin-V和PI熒光燃料與PS及DNA的結合特性，在流式細胞儀檢測的散點圖中可以區分出4種類型細胞：A象限內的細胞為死亡晚期細胞，Annexin-V為陰性而PI為陽性(AV^--PI⁺)；B象限內的細胞為壞死細胞，Annexin-V和PI均為陽性(AV⁺-PI⁺)，雖然這類小質膜滲透性受到損傷，但是質膜的完整性還是在一定程度上得到維持；C象限內的細胞為活細胞，Annexin-V和PI均為陰性(AV^--PI^-)，質膜的結構和功能均未發生變化；D象限內的細胞為活細胞，但處于凋亡早期狀態，Annexin-V為陽性而PI為陰性(AV⁺-PI^-)這類處于凋亡早期的細胞雖然結構仍然保持著一定的完整性，但是質膜結構受到了一定程度的損傷，是一定量的PS開始由質膜的內側轉移到外側，質膜的通透性增大，早期凋亡率可以作為污染物毒性評價的敏感指標，用于對污染物毒性的早期預警。

經對現有技術的文獻檢索發現，PLYTYCZ?Barbara等在《European?journalof?soil?biology》(歐洲土壤生物)(2007，43：116-120)上發表的“Flowcytometric?measurement?of?neutral?red?accumulation?in?earthwormcoelomocytes：Novel?assay?for?studies?on?heavy?metal?exposure”(細胞流式技術檢測蚯蚓體腔細胞中性紅積累：檢測重金屬暴露的新方法)，該文中提出細胞流式技術是一種快速檢測無脊椎動物體腔細胞中溶酶體中性紅積累情況的方法，并依據中性紅積累的量來評價環境污染狀況。具體方法為：重金屬Cu對不同種無脊椎動物的體腔細胞進行體外脅迫，用中性紅對體腔細胞染色，利用細胞流式技術檢測無脊椎動物體腔細胞中溶酶體中性紅積累情況，結果表明無脊椎動物體腔細胞中溶酶體中性紅積累的多少可作為Cu污染的生物標志物。其不足在于：該方法局限于體外細胞染毒，以中性紅積累作為檢測指標，實驗周期長，靈敏度較差，不能真實反映指示生物受到污染物脅迫下體腔細胞的損傷情況，因而不適用于對土壤污染的監測和預警。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種以蚯蚓體腔細胞作為標志物的土壤重金屬和多環芳烴復合污染預警方法，使其以蚯蚓體腔細胞作為生物標志物對土壤重金屬和多環芳烴復合污染進行監測和預警，能對土壤污染檢測起到很好的警示作用。

本發明是通過以下技術方案實現的，包括以下步驟：

第一步，將指示生物染毒，按照OECD?207推薦標準方法(1984年，經濟合作與發展組織，化學品測試導則207《蚯蚓急性毒性試驗》)將安德愛勝蚓(Eisenia?andrei)在土壤中染毒。

第二步，提取蚯蚓體腔細胞，用纖維針結合超聲波刺激法提取蚯蚓的體腔細胞，步驟為：①蚯蚓清腸；②將纖維針細管插入蚯蚓體腔；③用超聲波儀震蕩刺激蚯蚓：④細胞記數和鏡檢。

纖維針選用長1cm，內徑為0.5mm中空的纖維針細管，所選用的超聲波儀頻率為28KHz、功率為300W，震蕩刺激蚯蚓的時間為2s。