[發(fā)明專利]乙型肝炎病毒表面抗原檢測微粒、其制備及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810042392.2
• 申請日: 2008-09-02
• 公開（公告）號: CN101666801A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張偉;吳旸;王海蛟;趙衛(wèi)國
• 申請（專利權(quán)）人: 博陽生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576;G01N33/52;G01N33/543;G01N21/64;G01N21/76
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及乙肝的診斷試劑，具體涉及基于光激化學(xué)發(fā)光原理的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)檢測顆粒、其制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)

免疫學(xué)檢測是基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對被檢測信號進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。

我國免疫學(xué)檢測基本經(jīng)歷了放射免疫檢測(興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院)；酶聯(lián)免疫檢測(興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用)；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測技術(shù)(20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期)三個階段。這一衍變過程主要是基于對檢測方法的敏感性、準(zhǔn)確性、以及操作簡捷性的需求的不斷提高而決定的。

化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence?Immunoassay)是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號放大系統(tǒng)并籍助其發(fā)光強(qiáng)度直接測定免疫結(jié)合。由于其高靈敏度，檢測范圍寬等優(yōu)點，已成為放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學(xué)檢測重要的發(fā)展方向。

但目前國內(nèi)自行研制的化學(xué)發(fā)光檢測試劑，大多為非均相反應(yīng)，采用化學(xué)底物直接標(biāo)記，通過化學(xué)反應(yīng)激發(fā)。其分析過程與傳統(tǒng)酶標(biāo)檢測類似，需反復(fù)清洗與分離，檢測耗時長，自動化程度不高。國外廠家檢測試劑隨發(fā)光基質(zhì)與檢測形式而各不相同。以Abbott，Bayer與Chiron等公司為代表的化學(xué)激發(fā)，即以化學(xué)發(fā)光底物直接標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫測定。最常用的為吖啶酯，在堿性環(huán)境中可被過氧化氫氧化而發(fā)光。BD則以AKP，金鋼脘為基質(zhì)采用酶促化學(xué)發(fā)光。Roche為則采用電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)，發(fā)光底物二價的三聯(lián)吡啶釕及反應(yīng)參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個H+而成為強(qiáng)還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發(fā)態(tài)的二價釕，隨即釋放光子而恢復(fù)為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。因反應(yīng)過程中牽涉到分離清洗，自動化設(shè)計復(fù)雜，儀器相當(dāng)昂貴。此外，發(fā)光基質(zhì)的穩(wěn)定性也是一大問題。

光激化學(xué)發(fā)光法通過引入激光技術(shù)與納米微球技術(shù)，成功地解決了上述不足。因反應(yīng)在均相中進(jìn)行，既加快了反應(yīng)速度，又避免了反復(fù)分離與清洗步驟，能有效降低檢測背景值，減少反應(yīng)時間，并可實現(xiàn)自動化操作。目前，PE公司推出了針對生物研究用的光激化學(xué)發(fā)光試劑Alpha-Screen。但在臨床檢測領(lǐng)域，還沒有面世的光激化學(xué)發(fā)光檢測試劑，尤其是用于腫瘤標(biāo)志物與肝炎檢測項目。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種可用于定性或定量檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測微粒，其制備、檢測條件及應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)原理：

本發(fā)明的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測試劑及試劑盒與光激化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相關(guān)，光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光波進(jìn)行免疫測定的方法。該技術(shù)主要整合了高分子微粒技術(shù)，有機(jī)合成，蛋白質(zhì)化學(xué)與臨床檢測相關(guān)領(lǐng)域的研究。

本發(fā)明之所以能檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，是由于在均相條件下，將內(nèi)部帶有染料的感光微粒(納米級)以及包被有表面抗體(HBsAb)并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒(納米級)的混合物作為試劑和檢測樣品混合。此時納米感光微粒和包被有表面抗體(HBsAb)的納米發(fā)光微粒可迅速有效地捕捉HBeAg，在近距離內(nèi)，三者形成免疫夾心復(fù)合物。激發(fā)光照射后，納米感光微粒中的染料被誘導(dǎo)激活，并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離的納米發(fā)光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級紅光。用光子計數(shù)器測定這些高能級光子，并通過電腦將光子數(shù)換算為目標(biāo)分子濃度，光子數(shù)的多少即精確地反映了目標(biāo)分子的濃度。而當(dāng)樣本不含HBeAg時，無法在近距離形成免疫夾心復(fù)合物，活性氧離子也無法傳遞至發(fā)光微粒表面。活性氧離子在液相中迅速衰減，檢測時則無高能級紅光產(chǎn)生。具體原理參見圖1及圖2。

基于上述原理，本發(fā)明第一方面提供了一種用于檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測微粒，為乙型肝炎表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒。