[發明專利]一種抑癌能力遺傳風險評估的基因檢測方法

無效

• 申請號: 200810042027.1
• 申請日: 2008-08-25
• 公開（公告）號: CN101560549A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 傅詠南;毛丹丹;王校
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 翁若瑩

1.一種抑癌基因遺傳風險評估的基因檢測方法，其特征在于，其方法為：

步驟1.檢測的樣品類型與采樣方法：

用采樣拭在20-30個被測者口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的細胞樣本；

步驟2.基因組DNA的抽提方法：

采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時-2.5小時，共抽提20-30個被測者樣本，經電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測；

步驟3：熒光定量PCR反應

將每一個被測者樣本分別放入3個反應孔，同時檢測抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ?ID?NO1：T-885G、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ?ID?NO2：Gln1136Lys、抑癌基因TP53(TP53)SEQ?ID?NO3：Arg72Pro?3個位點，20-30個被測者樣本就有60-90個反應孔，并增設不含DNA模版的NTC空白對照孔；

每一個反應孔的基因分型根據下表的引物和探針設計，采用-MGB技術，進行檢測試劑合成；

在每一個反應孔中加入試劑為熒光定量PCR反應體系，總體積為10μl，即濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl?10X熒光定量PCR反應緩沖液ABIMGB、0.1μl?25mM?d?NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5μl?25mM?MgCl₂溶液、0.02μl(5units/μl)Taq?DNA聚合酶、去離子水5.43μl、3個位點分別采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC熒光探針(10μM，0.25μl)和FAM熒光探針(10μM，0.25μl)工具進行檢測，

將61-91個反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然后再進行60個循環的95℃、30秒，60℃、1分鐘、反應結束后取出后再放入ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，并自動將20-30個被測者樣本檢測3個點位的數據對號入座到3個圖中，同時生成3張圖，是抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ?ID?NO1：T-885G圖、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ?ID?NO2：Gln1136Lys圖、抑癌基因TP53(TP53)SEQ?ID?NO3：Arg72Pro圖；

步驟4：SNP基因型分析

將ABI7900型熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的3個表和一個NTC空白對照進行比較，每個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；

(1)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ?ID?NO1：T-885G

在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，坐標軸(X：0.4-0.5Y：0.3-0.4)區域為空白對照、坐標軸(X：0.2-0.4Y：1.1-1.3)區域為TT基因型、坐標軸(X：0.6-0.8Y：0.7-1.0)區域為TG基因型、坐標軸(X：0.7-0.9Y：0.3-0.4)區域為GG基因型，其中，TT、TG為風險基因型，攜帶風險基因型時，蛋白質翻譯減少或編碼突變型蛋白質時均可導致細胞的惡變，導致癌癥易感性增加；

(2)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ?ID?NO2：Gln1136Lys

在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，坐標軸(X：0.0-0.1Y：0.1-0.3)區域為空白對照、坐標軸(X：0.0-0.1Y：1.1-1.3)區域為AA基因型、坐標軸(X：0.2-0.3Y：0.9-1.2)區域為AG基因型、坐標軸(X：0.35-0.45Y：0.4-0.6)區域為CC基因型，其中，AA為風險基因型，攜帶風險基因型時，蛋白質翻譯減少或編碼突變型蛋白質時均可導致細胞的惡變，導致癌癥易感性增加；

(3)、抑癌基因TP53(TP53)SEQ?ID?NO3：Arg72Pro

在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，坐標軸(X：0.0-0.1Y：0.3-0.4)區域為空白對照、坐標軸(X：0.1-0.3Y：1.6-1.9)區域為CC基因型、坐標軸(X：0.6-0.8Y：1.1-1.4)區域為CG基因型、坐標軸(X：0.9-1.1Y：0.4-0.6)區域為GG基因型，其中，CC為風險基因型，攜帶風險基因型時，蛋白質翻譯減少或編碼突變型蛋白質時均可導致細胞的惡變，導致癌癥易感性增加；

每一個被測者的3個點落在3個表上哪個區域，即可知道被測者抑癌基因的遺傳風險。