[發明專利]一種檢測毛發中克侖特羅殘留量的方法

有效

• 申請號: 200810041833.7
• 申請日: 2008-08-19
• 公開（公告）號: CN101458238A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發明（設計）人: 劉罡一;張夢琪;陸川;李水軍;賈晶瑩;余琛
• 申請（專利權）人: 上海市徐匯區中心醫院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02;G01N30/34
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 俞宗耀

技術領域

本發明涉及一種毛發中克侖特羅殘留量的檢測方法，尤其涉及一 種利用氘代克侖特羅為內標，以液相色譜-串聯質譜法(簡稱LC-MS/MS 法)定量檢測毛發中克侖特羅殘留量方法。

背景技術

克侖特羅(Clenbuterol)可明顯促進動物生長，改善動物體內 脂肪分配增加瘦肉率，故俗稱“瘦肉精”。基于臨床食用動物內臟而 導致的克侖特羅中毒事件的不斷發生，世界各國普遍禁止在飼料中添 加克侖特羅類藥物。1997年以來我國已多次明令禁止畜牧行業使用 克侖特羅，但各地中毒事件仍頻有發生，說明非法使用克侖特羅現象 依然存在，食品安全的監管力度尚有待加強。

目前克侖特羅殘留量的常用測定方法包括酶聯免疫法(ELISA)、 高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)、氣相色譜-質譜法 (GC-MS)和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)。ELISA因操作簡便、 檢測迅速、成本低廉，通常作為篩選法用于動物組織或者尿液中的殘 留篩查，其缺點是靈敏度低，而且假陽性率高。GC-MS可用于多殘留 情況下的定性、定量分析，與HPLC和CE相比，具有更高的靈敏度和 特異性，因此，我國將CG-MS法定為檢測克侖特羅的確證性方法。 其缺點是樣品需要衍生化、處理過程煩瑣、檢測時間長。

克侖特羅能特異地與毛發中的色素牢固結合，且殘留量大、消除 緩慢、維持時間長。即使在較長的停藥期下，克侖特羅在毛發中的殘 留仍能被檢出。如牛在停服瘦肉精(0.8μg/kg，2次/日，共10天) 60天后，從其毛發中仍能檢出瘦肉精。以毛發作為檢材，較其他組 織、血液和尿液等更可靠，并具有采樣方便、非損傷性特點，有利于 實現屠宰前連續動態監測，故毛發被認為是檢測鹽酸克侖特羅非法使 用最好的樣品。

在2003年公布的地方標準DB33/T?455-2003《動物毛發中鹽酸 克侖特羅的檢測方法》中，采用乙酸乙酯液-液萃取和固相萃取相結 合的方法，提取毛發堿水解液中的克侖特羅后供酶聯免疫和氣質聯用 (GC-MS)測定，檢測限為8.0ng/g。該方法的檢測的靈敏度和專一 性有限，樣品預處理過程煩瑣費時(僅固相萃取就約需要2個小時)， 可操作性較差，難以應對大批量的毛發樣品監測任務。

LC-MS/MS法兼有液相色譜良好的分離能力和串聯質譜靈敏特異 的檢測能力，是近年來迅速發展的檢測技術，但在毛發樣品中檢測克 侖特羅殘留量未見報道。

現有克侖特羅檢測技術大多存在采樣不便、樣品處理過程復雜、 樣品處理成本較高、檢測靈敏度和特異性低等不足，限制了克侖特羅 殘留檢測在我國食品安全供給保障體系中的作用，因此研究選擇方便 可靠的檢材、簡單快速的樣品前處理方法及準確有效的檢測手段具有 非常重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的在于，鑒于當前食品安全供給保障體系建設的迫切 需求及現有克侖特羅檢測方法的不足，提供一種準確可靠、靈敏度高， 可適用于大批量毛發樣品中克侖特羅殘留量檢測的液相色譜-串聯質 譜法(LC-MS/MS)。

本發明的另一目的在于提供簡單快速、成本較低的毛發樣品前處 理方法。

為達到上述目的，采用的技術方案是：一種檢測毛發中克侖特羅 殘留量的方法，其特征在于：依次包括(1)毛發樣品前處理：高溫 堿水解、有機溶劑萃取、再用酸水反萃取；(2)以濃度為5-500ng/ml 的氘代克侖特羅-D9水溶液為內標，以液相色譜-串聯質譜法檢測毛 發中克侖特羅殘留量。

所述毛發樣品前處理是指：毛發樣品用清洗溶劑清洗，晾干，剪 碎；取適量毛發，加所述內標溶液，再加入堿溶液在高溫下使毛發水 解，然后加入固體鹽鹽析和有機溶劑旋渦混合提取，離心分層，取有 機層用酸水反萃取，再離心分層后，取水層作液相色譜-串聯質譜法 進樣樣品。

所述毛發清洗劑是水和甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷或稀鹽酸。

所述水解用堿溶液是氫氧化鈉、或氫氧化鉀、或氨水，濃度為 0.5-5mol/L，水解溫度為60-100℃，加熱2min-1h。

所述固體鹽是Na₂SO₄、或NaCl；所述有機溶劑是乙醚、乙酸乙酯、 特丁基甲醚、二氯甲烷、氯仿中的一種；所述反萃取的酸水溶液是甲 酸或乙酸，濃度為0.5-5％(v/v)。