[發(fā)明專利]建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細(xì)胞模型的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810041461.8
• 申請(qǐng)日: 2008-08-07
• 公開（公告）號(hào): CN101333532A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 殷明;沈穎華;石莎;聶惠貞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，特別是一種建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細(xì)胞模型的方法。

背景技術(shù)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s?Disease，AD)是一種以進(jìn)行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。阿爾茨海默病的病理生理特征主要包括神經(jīng)元中的神經(jīng)纖維纏結(jié)、細(xì)胞內(nèi)Aβ產(chǎn)生和神經(jīng)元外Aβ聚集形成的淀粉樣斑塊。Aβ由淀粉樣前體蛋白(amyloid?precursor?protein，APP)經(jīng)過特定的途徑加工修飾而成。

煙堿型乙酰膽堿受體為配體門控型離子通道，是由不同基因各自編碼的5種不同亞單位(α，β，γ，δ，ε)形成的五聚體結(jié)構(gòu)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要表達(dá)的有α7和α4β2兩種nAChR亞型。神經(jīng)生物學(xué)研究顯示，中樞煙堿受體亞型激動(dòng)可以改善認(rèn)知功能；在對(duì)APP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)長時(shí)間經(jīng)口途徑給予尼古丁也可顯著降低腦中β淀粉樣蛋白量且伴有α7煙堿型乙酰膽堿受體水平上調(diào)。在文獻(xiàn)The?consequences?of?reducing?expression?of?the?alpha7?nicotinic?receptor?by?RNA?interference?and?of?stimulating?its?activitywith?an?alpha?7?agonist?in?SH-SY5Y?cells?indicate?that?this?receptor?playsa?neuroprotective?role?in?connection?with?the?pathogenesis?of?Alzheimer’sdisease.Neurochemistry?International.51，377-383中作者Qi，X通過RNA干擾的方法觀察到經(jīng)由α7受體亞型所介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，主要包括可溶性淀粉樣前體蛋白的增加和淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的降低。這也印證了Marina?R.Picciotto等人提出的包括α7在內(nèi)的中樞煙堿型乙酰膽堿受體對(duì)神經(jīng)退行性疾病可起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體涉及到的受體亞型和機(jī)制并不清楚。因此，建立高通量特異性受體作用的細(xì)胞篩選模型用于新藥先導(dǎo)化合物篩選，藉此模型進(jìn)行特定化合物作用類型及效價(jià)和效能的研究，利用此細(xì)胞模型進(jìn)行受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物學(xué)機(jī)制研究等，都是亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種建立神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細(xì)胞模型的方法。本發(fā)明在體外模擬阿爾茨海默病的病理特征之一：β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的過度增多，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，實(shí)現(xiàn)了建立人淀粉樣前體蛋白和人煙堿型乙酰膽堿受體共表達(dá)的細(xì)胞模型，對(duì)于觀察α7煙堿受體亞型的激動(dòng)對(duì)內(nèi)源性APP加工修飾的影響，從而為篩選具有更高效能的治療阿爾茨海默病的藥物提供了基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，具體步驟如下：

第一步、表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-APP695的構(gòu)建：將APP695基因克隆進(jìn)pcDNA3.1(-)質(zhì)粒，選擇Hind?III和Xba?I為進(jìn)行雙酶切的工具酶；

第二步、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：將pcDNA3.1(-)-APP695用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染進(jìn)SH-EP1-α7細(xì)胞并用篩選抗生素進(jìn)行加壓篩選；然后用有限稀釋法將細(xì)胞進(jìn)行單克隆化；

第三步、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆APP695mRNA表達(dá)的鑒定：用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)APP695mRNA表達(dá)；

第四步、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆APP695和Aβ蛋白表達(dá)的鑒定：用Western-blotting檢測(cè)細(xì)胞克隆APP695蛋白表達(dá)；用ELISA檢測(cè)細(xì)胞外液中Aβ的表達(dá)：

a.檢測(cè)細(xì)胞克隆APP695：

對(duì)RT-PCR挑選出的陽性克隆，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白；

用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，10μg上樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜半干電轉(zhuǎn)移，一抗室溫孵育3h，二抗室溫孵育1h，ECL熒光檢測(cè)，顯影定影并且拍照。

b.檢測(cè)Aβ：用含有蛋白酶抑制劑PMSF和AEBSF的裂解液裂解細(xì)胞；

BCA法測(cè)定蛋白濃度，取30.5μg上樣進(jìn)行Tris-tricine電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，一抗室溫孵育3h，二抗室溫孵育1h，ECL熒光檢測(cè)，顯影定影并拍照。