[發明專利]建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法

無效

• 申請號: 200810041461.8
• 申請日: 2008-08-07
• 公開（公告）號: CN101333532A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 殷明;沈穎華;石莎;聶惠貞
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1、一種建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步、表達載體pcDNA3.1(-)-APP695的構建：將APP695基因克隆進pcDNA3.1(-)質粒，選擇Hind?III和Xba?I為進行雙酶切的工具酶；

第二步、穩定轉染：將pcDNA3.1(-)-APP695用脂質體方法轉染進SH-EP1-q7細胞并用篩選抗生素進行加壓篩選；然后用有限稀釋法將細胞進行單克隆化；

第三步、穩定轉染細胞克隆APP695?mRNA表達的鑒定：用逆轉錄-聚合酶鏈反應方法檢測APP695?mRNA表達；

第四步、穩定轉染細胞克隆APP695和Aβ蛋白表達的鑒定：用Western-blotting檢測細胞克隆APP695蛋白表達；用ELISA檢測細胞外液中Aβ的表達。

2、根據權利要求1所述的建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法，其特征是，所述的APP695基因和pcDNA3.1(-)進行Hind?III和Xba?I雙酶切，凝膠回收后用T4?DNA連接酶連接，轉化至DH5α感受態細胞，氨芐青霉素抗性篩選重組子pcDNA3.1-APP695，擴增提取質粒，測序鑒定。

3、根據權利要求1所述的建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法，其特征是，所述的穩定轉染，采用脂質體法將載體轉染。

4、根據權利要求1或3所述的建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法，其特征是，穩定轉染后收集單克隆細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，以RNA為模板，APP695引物1和引物2進行PCR。

5、根據權利要求4所述的建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法，其特征是，PCE程序具體為：94℃變性3分鐘進入循環過程，94℃變性1.5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4.3分鐘，經31個循環后72℃復性10分鐘；APP695引物為5’-tctccctgctctacaacgtg-3’和5’-cagccccaaaagaagcc-3’，凝膠電泳鑒定PCR產物。

6、根據權利要求1所述的建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法，其特征是，第四步中檢測細胞克隆APP695，是指：

對RT-PCR挑選出的陽性克隆，裂解細胞，提取細胞蛋白；

用酶標儀測定蛋白濃度，10μg上樣進行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜半干電轉移，一抗室溫孵育3h，二抗室溫孵育1h，ECL熒光檢測，顯影定影并且拍照。

7、根據權利要求1所述的建立神經元煙堿型乙酰膽堿亞型受體細胞模型的方法，其特征是，第四步中檢測Aβ蛋白表達，是指：

用含有蛋白酶抑制劑PMSF和AEBSF的裂解液裂解細胞；

BCA法測定蛋白濃度，取30.5μg上樣進行Tris-tricine電泳，PVDF膜濕轉，一抗室溫孵育3h，二抗室溫孵育1h，ECL熒光檢測，顯影定影并拍照。