[發(fā)明專利]一種獲得角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法及體外構(gòu)建角膜后板層

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810041062.1
• 申請(qǐng)日: 2008-07-28
• 公開（公告）號(hào): CN101638635A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范先群;邵春益
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/08
• 分類號(hào): C12N5/08;A61L27/38;A61F2/14
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張 睿

1.一種誘導(dǎo)形成角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：將2-8×10⁴個(gè)/ml的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(bone?marrow?derived?endothelial?progenitorcells，BEPCs)和0.6-3×10⁵個(gè)/ml的角膜內(nèi)皮細(xì)胞(coneal?endothlial?cell，CECs)共培養(yǎng)，使骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分化形成角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞；優(yōu)選將3-7×10⁴個(gè)/ml的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞和0.8-1.2×10⁵個(gè)/ml的角膜內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)。

2.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，共培養(yǎng)中所使用的培養(yǎng)液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；共培養(yǎng)7-14天；優(yōu)選8-10天。

3.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞是同種同體、同種異體或異種異體骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞；所述的角膜內(nèi)皮細(xì)胞是同種同體、同種異體或異種異體角膜內(nèi)皮細(xì)胞；所述的隔離共培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞之間是同種同體、同種異體或異種異體。

4.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的共培養(yǎng)選自混合共培養(yǎng)或隔離共培養(yǎng)；優(yōu)選隔離共培養(yǎng)。

5.如權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，在隔離共培養(yǎng)的第三天再加入角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液和新鮮培養(yǎng)液，間隔兩天后再通過半量換液法加入角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液和新鮮培養(yǎng)液；所述的培養(yǎng)液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；所述的角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液是為角膜內(nèi)皮細(xì)胞第一代或第二代細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。

6.一種如權(quán)利要求1-5任一所述的誘導(dǎo)方法獲得的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的用途，其特征在于，所述的用途是作為種子細(xì)胞制備角膜移植物。

7.一種組織工程化角膜后板層，其特征在于，它包括：

(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；和

(b)如權(quán)利要求1-5任一所述的誘導(dǎo)方法獲得的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞；

所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料是角膜脫細(xì)胞基質(zhì)(cornea?acellularmatrix，CACM)；優(yōu)選豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)(porcine?cornea?acellular?matrix，PCACM)。

8.如權(quán)利要求7所述的角膜后板層，其特征在于，如權(quán)利要求1-5任一所述的誘導(dǎo)方法獲得的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的含量為1000-4000個(gè)細(xì)胞/mm²所構(gòu)建的角膜后板層。

9.一種制備組織工程化角膜后板層的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟：

(1)將如權(quán)利要求1-5任一所述的誘導(dǎo)方法獲得的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞接種于角膜脫細(xì)胞基質(zhì)(優(yōu)選豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì))，接種密度為1000-4000個(gè)細(xì)胞/mm²角膜脫細(xì)胞基質(zhì)；和

(2)培養(yǎng)得到組織工程化角膜后板層。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(2)中加入體積比為1∶1-3的角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液和含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。