[發(fā)明專利]一種獲得角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法及體外構(gòu)建角膜后板層

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810041062.1
• 申請(qǐng)日: 2008-07-28
• 公開（公告）號(hào): CN101638635A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范先群;邵春益
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/08
• 分類號(hào): C12N5/08;A61L27/38;A61F2/14
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張 睿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織工程和眼科領(lǐng)域，尤其涉及獲得角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的方法及體外構(gòu)建角膜后板層。

背景技術(shù)

角膜內(nèi)皮細(xì)胞通過泵功能和屏障功能，調(diào)控了角膜的透明性。成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)隨著年齡增加、眼外傷、手術(shù)、接觸鏡佩戴和炎癥等因素而下降，但在體內(nèi)卻無法增殖來補(bǔ)償細(xì)胞損失，只能靠細(xì)胞體積增大來保持與相鄰細(xì)胞的緊密對(duì)合，阻止房水過多地滲入基質(zhì)。這是因?yàn)榍胺績?nèi)生長因子不足，同時(shí)房水中又存在生長抑制因子，阻斷了細(xì)胞的DNA合成，使其停滯在G1期，不能通過有絲分裂來繁殖再生。當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度低于400-700個(gè)/mm²時(shí)，內(nèi)皮失代償，角膜水腫，視力下降或喪失。臨床上內(nèi)皮失代償疾病如大泡性角膜病變、Fuch’s角膜變性等皆導(dǎo)致角膜內(nèi)皮病變，角膜混濁和視力下降。治療角膜內(nèi)皮功能失代償?shù)某Ｓ檬中g(shù)是穿透性角膜移植。盡管常規(guī)的角膜移植已經(jīng)取得了較大的成功，但仍存在不足之處，包括術(shù)后散光，屈光不正，縫線松脫感染，供體來源短缺及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等。角膜雖然處于一個(gè)相對(duì)免疫赦免的位置，但在無血管的角膜上行角膜移植術(shù)仍存在大于10％患者發(fā)生排斥反應(yīng)。1952年Stocker建立了角膜內(nèi)皮細(xì)胞組織培養(yǎng)方法，在此基礎(chǔ)上1972年Maurice首次提出了將組織培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植到內(nèi)皮細(xì)胞不健康的角膜上的設(shè)想，開辟了角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植(coneal?endothelium?transplantation)這一嶄新的研究領(lǐng)域。近幾年興起的角膜后彈力層剝除內(nèi)皮細(xì)胞移植術(shù)(Descemet?stripping?endothelialkeratoplasty，DSEK)，利用鞏膜隧道小切口，撕去后彈力層和內(nèi)皮層，再移植異體后板層基質(zhì)和后彈力層內(nèi)皮層，無需縫合，相比傳統(tǒng)的穿透性角膜移植術(shù)，創(chuàng)傷小，免疫排斥進(jìn)一步降低，術(shù)后視力恢復(fù)快、散光小，但依然存在供體缺乏、角膜供體老齡化等難題。目前熱點(diǎn)研究的體外培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植也因受到細(xì)胞來源不足和無合適的載體而難以應(yīng)用。因此，尋找種子細(xì)胞與合適的生物材料構(gòu)建組織工程角膜后板層并進(jìn)行移植是當(dāng)務(wù)之急。

組織工程學(xué)(tissue?engineering)是一門以細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)相結(jié)合，進(jìn)行體外或體內(nèi)構(gòu)建組織或器官的新興學(xué)科。組織工程的三大要素包括種子細(xì)胞、生物材料及體內(nèi)微環(huán)境。其基本方法是將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的自體正常組織細(xì)胞吸附于一種生物相容性良好并可被機(jī)體降解吸收的生物支架，植入機(jī)體組織缺損部位，在支架材料逐步降解過程中，細(xì)胞繼續(xù)增殖并分泌基質(zhì)，最終形成相應(yīng)組織，達(dá)到修復(fù)組織缺損，重建功能的目的。

目前用于構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的種子細(xì)胞有角膜內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮前體細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。1979年，Gospodarowicz等將培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞接種于貓的角膜片上，體外培養(yǎng)后再移植到內(nèi)皮受損的貓角膜上，植片保持透明達(dá)7天。這一實(shí)驗(yàn)開辟了角膜內(nèi)皮細(xì)胞載體培養(yǎng)和移植的新領(lǐng)域。但是內(nèi)皮細(xì)胞來源缺乏，體外雖能擴(kuò)增，但數(shù)量有限。2005年，Mimura等發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮周邊的細(xì)胞增殖能力要明顯超過中心的細(xì)胞，推測(cè)在近角膜緣與小梁組織結(jié)構(gòu)交界處可能存在類似干細(xì)胞的角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞；又有研究通過周邊角膜內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)塊克隆培養(yǎng)方法得到了干細(xì)胞樣的角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞，可以體外成克隆團(tuán)塊樣生長增殖，無論在形態(tài)上還是增殖力等生物學(xué)特性上都具有干細(xì)胞的特征，注入前房后能修復(fù)兔角膜內(nèi)皮缺損。但是角膜前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)非常困難。有學(xué)者在成體干細(xì)胞MSC的誘導(dǎo)和移植進(jìn)行了有益的探索。劉小韋等用兔自體BMSCs接種到明膠膜上移植到機(jī)械去除角膜內(nèi)皮細(xì)胞的兔角膜內(nèi)，術(shù)后8周水腫逐漸減輕，角膜恢復(fù)透明，術(shù)后12周逐漸分化為類似多角形的細(xì)胞，但是細(xì)胞間的間隙較大。MSC到底能否分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞還是未知數(shù)，移植后的效果還需長期觀察。