[發明專利]一種含COX-2基因啟動子和報告基因的重組質粒及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200810040524.8
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101624599A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 李琦;范忠澤;周利紅;王金玉;還一平;殷佩浩;秦建民;孫玨;許建華;劉寧寧
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬普陀醫院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/12;C12Q1/66;C12Q1/02
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種腫瘤基因靶點的重組質粒，具體涉及一種 含COX-2基因啟動子和熒光素酶報告基因的重組質粒及其構建方法和應用途徑。

背景技術

環氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(PGs)合成過程中一個重要的限速酶， 可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產物，從而維持機體的各種病理生理過程。目前 發現哺乳動物的環氧化酶至少有COX-1和COX-2兩個同工酶，COX-1在組織中的表 達相當穩定，對維持胃和腎功能的平衡發揮重要的作用，而COX-2的表達在不同的組 織、不同的狀況下變動很大，它的主要產物是環前列腺素和PGE₂。

現有技術公開了COX-2基因全長8.3kb，由10個外顯子和9個內含子組成，定位 于第1號染色體1q^25.2～25.3，由5’端0.8kb的轉錄起始點上游區，6kb的蛋白質編碼區 以及1.5kb?3’端非編碼區組成，其mRNA約4.5kb，基因編碼603或604個氨基酸， 含有17個氨基酸殘基構成的信號肽，與COX-1有59％-61％的同源性。在其5’旁側區， 含有幾個可能的轉錄調節序列，包括轉錄起始位點上游25bp位處共同的TATA框序 列。一個C/EBP基序，兩個AP-2位點，三個SP₁位點，兩個NF-κB位點，一個CRE 基序和一個EST-1位點。在蛋白質編碼區，COX-2基因的ORF起始于CTGCGATGC 序列，由10個外顯子編碼。在3’旁側區，整個3’UTR包含于外顯子10，其間無內含 子存在，有三個富含腺嘌呤核苷酸的序列M?TAAA，相互之間相隔280bp。

研究發現COX-2存在于某些細胞中，主要定位于核膜。因此，COX-2產生的PGs 產物可進入核內，調節靶細胞基因的轉錄。研究表明cox-2不僅是啟動炎癥反應的關 鍵酶，而且其表達和與腫瘤的發生、增殖、分化、浸潤、轉移及預后等方面有重要作 用。COX-2主要通過以下途徑導致胃癌的發生：：(1)COX作為一種刺激因子在靜 息狀態下不表達，只有在某些惡性細胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活 而被活化，COX-2的轉錄后失控，使COX-2過度表達，COX-2的過氧化酶活化可催 化一系列異體氧化反應，參與氧化誘癌途徑，從而形成致癌物。(2)COX-2通過催化 形成PGs促進腫瘤的發生，COX-2通過催化反應可產生PGG、PGH、PGE，其中PGE 為其主要代謝產物，可誘導細胞增殖，促進細胞粘附，抑制具有免疫調節功能的淋巴 因子的產生，抑制T細胞和B細胞增殖，降低機體對腫瘤細胞的局部免疫反應。(3) COX-2過度表達可增加PGE2的合成，PGE2誘導細胞增殖并刺激bc1-2蛋白表達， 降低介導凋亡的轉化生長因子-β(TGF-β)2型受體水平，降低介導細胞間粘附的E-鈣 粘蛋白(E-cadherin)活性，從而抵抗各種刺激誘導的細胞凋亡，促進細胞增殖，引起 腫瘤的發生。(4)COX-2促進PG合成的增加如PGE₁、PGE₂和15d-PGJ等作用于 EP₂、EP₄及PPARr等，通過EP/cAMP等途徑激活各種胞內激酶如PKA、Ras蛋白活 性，誘導VEGF?mRNA和蛋白表達水平上調，參與腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤的 轉移。(5)COX-2可使細胞周期存在明顯G₁期推遲，而且Czelin?D₁蛋白激酶、Rb₁激酶和細胞周期依賴激酶(CDK4)活性明顯下降，這樣通過阻礙細胞周期，阻止延長細 胞生存期，增強對胞外基質的粘附，而異常延長細胞生存期使一系列基因突變，促進 腫瘤形成。另外，Cox-2可促進腫瘤細胞相關血管的生成，增加癌細肥的侵襲性，激 活基質金居蛋白酶2降解細胞外基質，產生促血小板凝集的血栓烷等，從而有利于腫 瘤的侵襲和轉移。

COX-2在腫瘤發生、發展和轉移的整個過程中起著重要的作用，參與了腫瘤形成 的多個環節。因此，對腫瘤組織或腫瘤細胞中COX-2活性檢測可以作為監測腫瘤的發 生發展的一個重要手段，同時COX-2在細胞中的基因表達水平也可以作為抗腫瘤藥物 篩選的一個重要指標。

發明內容

本發明的目的是提供一種含COX-2基因啟動子和報告基因的重組質粒及其構建方 法，該報告基因為螢火蟲熒光素酶基因(luc⁺)。