[發明專利]一種乙醇酸氧化酶制劑、制備方法及應用

無效

• 申請號: 200810040498.9
• 申請日: 2008-07-11
• 公開（公告）號: CN101307307A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 潘江;朱虹;胡彬;許建和
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N11/14;C12P7/40
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 鄔震中

技術領域

本發明屬于生物化工領域，涉及黃花苜蓿乙醇酸氧化酶制劑、制備方法及其用于催化乙醇酸氧化生產乙醛酸的應用。

背景技術

乙醛酸(Glyoxylic?acid，GA)，又名二羥醋酸、甲酰甲酸，是最簡單的醛酸，分子中包含醛基和羧基兩種功能基團，因而兼有醛和羧酸的雙重特性，可同時發生醛、酸的反應，有時還會發生環化反應，是一種重要的有機合成中間體。從乙醛酸出發，可以衍生出幾十種有廣泛用途的精細化工產品，廣泛應用于香料、醫藥、農藥、食品添加劑等行業中。隨著乙醛酸應用范圍的擴大及后繼產品的開發，其市場容量不斷加大，對產品的質量提出更高的要求。加速研制、開發乙醛酸及其系列產品，對發展我國的乙醛酸工業具有重要的意義。

乙醛酸的合成方法包括化學合成法與生物合成法。工業上最常用的化學合成法有草酸電解還原法、乙二醛硝酸氧化法、馬來酸(酐)臭氧化法。一般而言，化學合成法工藝復雜，生產成本高，能耗大，并且有較嚴重的環境污染。以乙醇酸為底物，用乙醇酸氧化酶作為生物催化劑，進行乙醇酸生物轉化合成乙醛酸的生物合成法是現今乙醛酸生產的研究熱點，與化學合成法相比，具有能耗低，副產物少，環境污染小，產物的后續分離相對簡單等獨特優點。隨著環保措施的不斷加強，通過生物法合成乙醛酸是一種必然趨勢。

到目前為止，在生物法合成乙醛酸的研究中，使用的酶制劑主要是基因工程重組的菠菜乙醇酸氧化酶。例如，文獻J.Org.Chem.，1993，58：2253-2259報道：美國杜邦公司使用游離菠菜乙醇酸氧化酶作為催化劑，在過氧化氫酶以及FMN、乙二胺等添加劑的存在下，催化乙醇酸氧化合成乙醛酸。由于游離菠菜乙醇酸氧化酶的穩定性較差，反應需在低溫(15℃)下進行，游離酶無法重復使用。反應完畢后，通過對反應液加熱處理，使游離乙醇酸氧化酶變性沉淀，離心去除酶的沉淀后，才能從上清液中提取產物乙醛酸。

其后，杜邦公司直接使用含有酶的重組微生物細胞作為催化劑，催化乙醇酸氧化合成乙醛酸[J.Org.Chem.，1995，60：3957-3963]，反應完畢后，整細胞催化劑可以回收重復使用。由于存在較嚴重的細胞壁通透障礙，整細胞催化劑在使用前必須用化學試劑進行通透處理，考慮到酶的穩定性，反應仍然需在低溫(5℃)條件下進行。

低溫反應需要額外消耗能量，為了提高酶的溫度穩定性，有必要對酶進行改造或進行固定化。菠菜乙醇酸氧化酶的固定化已有專利報道(David?L.Anton，et?al.US?Patent?005,439,813A)，選用的載體是環氧樹脂，酶活力回收率低，僅為17％，而且商品化的環氧樹脂價格昂貴，不適于大規模生產應用。

本發明針對以上局限，通過廣泛篩選，發現植物黃花苜蓿(俗稱“草頭”)中存在高活力的乙醇酸氧化酶，這種植物的乙醇酸氧化酶尚未見文獻報道。與菠菜乙醇酸氧化酶相比，黃花苜蓿乙醇酸氧化酶性能優良，原料充足，酶的提取簡便，是生物合成乙醛酸的良好生物催化劑；我們還進一步開發了一種簡便、低成本且高效率的酶固定化方法，使用自行制備的納米磁粉材料，通過簡單的物理吸附方法即可很容易地實現乙醇酸氧化酶的固定化；在酶催化反應完成后，使用磁鐵即可可以很容易地進行固定化酶的回收，并且進行重復使用，工藝過程非常簡單，經濟成本也相對較低。

發明內容

本發明的目的是提供一種黃花苜蓿乙醇酸氧化酶制劑；

本發明的目的還提供一種上述黃花苜蓿乙醇酸氧化酶制劑的制備方法；

本發明的另一目的是提供一種上述黃花苜蓿乙醇酸氧化酶制劑.

本發明的乙醇酸氧化酶制劑是采用硫酸銨沉淀法自黃花苜蓿植物破碎液中提取獲得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。所述的乙醇酸氧化酶的等電點pI＞9.0，反應的最適pH與反應溫度分別為9.0和15℃，表觀米氏常數K_m與V_max分別為0.138mmol/L和0.173mmol·min^-1/g蛋白。

根據乙醇酸氧化酶是高等植物光呼吸途徑中的關鍵酶這一特征，本發明人對多種具有較強光呼吸的C₃植物進行了乙醇酸氧化酶含量與活力的比較。

本發明的乙醇酸氧化酶篩選方法簡述如下：

(1)初篩：稱取相同重量的不同種類C₃植物的新鮮葉片，加入預冷的緩沖液，研磨獲得植物細胞破碎液，測定破碎液中乙醇酸氧化酶活力以及蛋白質含量。