[發(fā)明專利]一種乙醇酸氧化酶制劑、制備方法及應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810040498.9
• 申請(qǐng)日: 2008-07-11
• 公開（公告）號(hào): CN101307307A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘江;朱虹;胡彬;許建和
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04;C12N11/14;C12P7/40
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 鄔震中

1.一種乙醇酸氧化酶制劑，其特征在于：所述的乙醇酸氧化酶是采用硫酸銨沉淀法自黃花苜蓿植物破碎液中提取獲得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。

2.如權(quán)利要求1所述的乙醇酸氧化酶制劑，其特征在于：所述的乙醇酸氧化酶的等電點(diǎn)pI＞9.0，反應(yīng)的最適pH與反應(yīng)溫度分別為9.0和15℃，表觀米氏常數(shù)K_m與V_max分別為0.138mmol/L和0.173mmol·min^-1/g蛋白。

3.一種如權(quán)利要求1所述的乙醇酸氧化酶制劑的制備方法，其特征在于所述的乙醇酸氧化酶采用如下(1)或(2)步驟分別獲得乙醇酸氧化酶的粗酶粉制劑或磁粉固定化酶制劑：

(1)乙醇酸氧化酶粗酶粉制劑：

將新鮮黃花苜蓿葉片破碎、離心，收集上清液，緩慢加入硫酸銨粉末待完全溶解后，繼續(xù)緩慢攪拌30min，收集沉淀的蛋白質(zhì)，加入適量乳糖作為凍干保護(hù)劑，冷凍干燥后制得粗酶粉制劑；所述的上清液與硫酸銨的重量比為1∶(0.1～0.6)；蛋白質(zhì)與乳糖的重量比為1∶(0.5～2)；

(2)磁粉固定化乙醇酸氧化酶制劑：

將新鮮黃花苜蓿葉片破碎、離心，收集上清液，緩慢加入硫酸銨粉末，收集沉淀的蛋白質(zhì)，溶解于pH為6～9的緩沖液中，透析除去硫酸銨，然后加入磁性納米顆粒作為固定化載體，通過吸附和洗滌制成磁粉固定化酶制劑；所述的上清液與硫酸銨的重量比為1∶(0.1～0.6)；蛋白質(zhì)和緩沖液重量比為(1～5)∶1000；透析時(shí)間5～12h；透析膜孔徑12000～14000Da。

4.如權(quán)利要求3所述的乙醇酸氧化酶制劑的制備方法，其特征在于步驟(2)進(jìn)行硫酸銨沉淀酶時(shí)，所加硫酸銨的量為10％～70％的飽和度；所述的緩沖液是磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的磁性納米顆粒固定化載體為用水熱合成法制備所得的氨基化磁性納米顆粒；酶蛋白質(zhì)與磁性載體的重量比為1∶(10～100)，固定化溫度為15℃～30℃，固定化時(shí)間為12～24小時(shí)。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述磁性納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

將1，6-己二胺的含量為8～12％(w/v)、無水乙酸鈉的含量為9～15％(w/v)和FeCl₃·6H₂O的含量為2～5％(w/v)的乙二醇溶液于170～250℃靜置反應(yīng)4～10小時(shí)后生成的黑色沉淀的磁性納米顆粒，依次用熱水和乙醇反復(fù)洗滌，烘干，備用。

7.一種如權(quán)利要求1所述的乙醇酸氧化酶制劑應(yīng)用于催化氧化乙醇酸制備乙醛酸。

8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的制備為：在50mM～1000mM的pH為7.0～10.0的乙醇酸溶液，加入如權(quán)利要求3(1)或(2)所述的乙醇酸氧化酶制劑，在10～35℃反應(yīng)0.2～72h；其中，基于底物量的乙醇酸氧化酶制劑使用量為10～100U/mol乙醇酸。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：在制備時(shí)添加適量的乙二胺、黃素單核苷酸以及過氧化氫酶，乙二胺與乙醇酸的摩爾比為：(1～1.2)∶1；黃素單核苷酸的濃度為0.01～0.1mM；過氧化氫酶的添加量為(1～10)×104U/ml。