[發明專利]利用組織培養生產大豆異黃酮的方法

無效

• 申請號: 200810040456.5
• 申請日: 2008-07-10
• 公開（公告）號: CN101318947A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 曹越平;陳冰;周斐紅;朱筠
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07D311/36
• 分類號: C07D311/36;A01H4/00
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種農業技術領域的生產方法，具體涉及一種利用組織培養生產大豆異黃酮的方法。

背景技術

大豆異黃酮(soybean?isoflavones)是大豆在生長過程中形成的次級代謝產物，是生物黃酮中的一種，也是一種植物雌激素，其有效成分主要是染料木素(genistein)和大豆苷元(daidzeiII)。大豆異黃酮是大豆中一類非常重要的非營養成分，它具有抗氧化、抗癌、提高免疫力、防止骨質疏松、類似雌性激素的作用。目前發現的天然存在的大豆異黃酮為多酚類化合物，主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中。目前國內外主要采用直接從大豆中提取異黃酮；從大豆加工后的中間產物和廢棄物中提取異黃酮，以及用分解與合成的方法生產大豆異黃酮。目前采用的技術大部分是直接從大豆粉、豆粕中提取大豆異黃酮。

經對現有技術文獻的檢索發現，中國專利申請號為200710047155.0，發明名稱為：生產大豆異黃酮的方法的專利中公開了一種通過農根桿菌侵染大豆無菌苗的不同部位產生毛狀發根，利用發根培養高效生產大豆異黃酮的方法。此方法是通過發根農桿菌侵染大豆無菌苗不同部位，產生毛狀根，通過對毛狀根的培養生產大豆異黃酮。這種方法得到的毛狀根在擴大培養前要進行多次除菌，過程比較繁瑣，對操作人員的要求較高，方法不易掌握。另外不同的發根農桿菌對不同的大豆品種的侵染能力不同，導致產生發根的效率有很大差別，在加上操作者的不同，使得這種產生發根方法的穩定性受到影響。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種利用組織培養生產大豆異黃酮的方法。本發明中的生產方法利用不同的大豆外植體，經過誘導培養得到大量的愈傷組織，從愈傷組織中提取大豆異黃酮，從而生產大豆異黃酮。這種方法不受季節及生育期的限制，方便，易操作，穩定性強。

本發明是通過以下技術方案實現的：

第一步，大豆無菌苗的獲得：取成熟的大豆種子，用滅菌劑進行滅菌，然后將大豆種子接種到萌發培養基上，經過培養得到大豆無菌苗；

所述滅菌劑是指氯氣或者過飽和漂白粉精片溶液。

所述大豆種子在萌發培養基上的培養溫度為24℃到26℃。

所述大豆種子在萌發培養基上的培養時間為7到10天。

所述萌發培養基為MS固體培養基，B5固體培養基，或MS固體培養基的無機成分加上B5固體培養基的有機成分。

第二步，外植體誘導愈傷組織：切取在第一步中得到的大豆無菌苗的組織，包括下胚軸、子葉節、子葉、真葉及根等部位，接種到愈傷組織誘導培養基中，每30天繼代培養1次，連續繼代培養3次；

所述愈傷組織誘導培養基，為以下三種培養基中任取一種：

1、MS固體培養基的無機成分，加上B5固體培養基的有機成分，同時在該混合固體培養基中添加濃度為0.1mg/L的6-芐氨基腺嘌呤與濃度為1.0mg/L的2，4二氯苯氧乙酸，余量為瓊脂和滅菌水。

2、MS固體培養基，同時在該固體培養基中添加濃度為0.1mg/L的6-芐氨基腺嘌呤與濃度為1.0mg/L的2，4二氯苯氧乙酸，余量為瓊脂和滅菌水。

3、B5固體培養基，同時在該固體培養基中添加濃度為0.1mg/L的6-芐氨基腺嘌呤與濃度為1.0mg/L的2，4二氯苯氧乙酸，余量為瓊脂和滅菌水。

第三步，大豆異黃酮的提取：用乙醇從第二步中得到的愈傷組織中提取大豆異黃酮。

所述乙醇是指體積濃度為70％-80％的乙醇溶液。

所述用乙醇從愈傷組織中提取大豆異黃酮的方法是指：將愈傷組織打碎，用70％-80％的乙醇提取，以0.5g樣品中使用5ml乙醇的配比進行提取。

本發明中利用組織培養生產大豆異黃酮的方法利用不同的大豆外植體，經過誘導培養得到大量的愈傷組織，從愈傷組織中提取大豆異黃酮，從而生產大豆異黃酮。經紫外分光光度計法檢測愈傷組織中大豆異黃酮的主要有效成分染料木素和大豆甙元的含量，在愈傷組織誘導培養90天后，愈傷組織中大豆異黃酮的總含量可以達到培養前大豆外植體中總含量的100倍以上，從而達到高效生產大豆異黃酮的目的。本方法工藝簡單，操作方便，可用于以大豆為材料的大豆異黃酮生產，同樣也可以用于其它豆科植物材料(如野生及多年生野生大豆等)。

具體實施方式