[發(fā)明專利]一種DNA損傷修復(fù)能力遺傳風(fēng)險評估的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810040317.2
• 申請日: 2008-07-08
• 公開（公告）號: CN101302562A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 傅詠南;王校;毛丹丹
• 申請（專利權(quán)）人: 上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 翁若瑩

1.一種DNA損傷修復(fù)能力遺傳風(fēng)險評估的方法，其特征在于，其方法為：

步驟1.檢測的樣品類型與采樣方法：

用采樣拭在20-30被測者口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的細(xì)胞樣本；

步驟2.基因組DNA的抽提方法：

采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時間為2小時-2.5小時，共抽提20-30個被測者樣本，經(jīng)電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢測；

步驟3：熒光定量PCR反應(yīng)

將每一個被測者樣本分別放入5個反應(yīng)孔，同時檢測5個位點(diǎn)，即多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP1)SEQ?ID?NO1：Val762Ala、人類X射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)SEQ?ID?NO2：Arg194Trp、人類X射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)SEQ?ID?NO3：Arg399Gln、切除修復(fù)復(fù)合物2(ERCC2)SEQ?ID?NO4：Lys751Gln、切除修復(fù)復(fù)合物2(ERCC2)SEQ?ID?NO5：Asn312Asp；20-30個被測者樣本就有100-150個反應(yīng)孔，另外根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要增設(shè)不含DNA模版的NTC空白對照孔；

每一個反應(yīng)孔的基因分型可以根據(jù)下表的引物和探針設(shè)計，采用TaqMan-MGB技術(shù)，進(jìn)行檢測試劑合成；

在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，總體積為10μl，即濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl?10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液ABI?TaqmanMGB、0.1μl?25mM?d?NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5μl?25mM?MgCl₂溶液、0.02μl(5units/μl)Taq?DNA聚合酶、去離子水4.98μl、5個位點(diǎn)分別采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC熒光探針(10μM，0.25μl)和FAM熒光探針(10μM，0.25μl)工具進(jìn)行檢測(詳見下表)；

將101-151個反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，先進(jìn)行預(yù)熱：50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然后再進(jìn)行60個循環(huán)的95℃、30秒，60℃、1分鐘、反應(yīng)結(jié)束后取出后再放入ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，并自動將20-30個被測者樣本檢測5個點(diǎn)位的數(shù)據(jù)對號入座到5個圖中，同時生成5張圖，即多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP1)SEQID?NO1圖；Val762Ala、人類X射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)SEQID?NO2圖；Arg194Trp、人類X射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)SEQ?ID?NO3圖；Arg399Gln、切除修復(fù)復(fù)合物2(ERCC2)SEQ?ID?NO4圖；Lys7516ln、切除修復(fù)復(fù)合物2(ERCC2)SEQ?ID?NO5圖；

步驟4：SNP基因型分析

將ABI7900型熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的5個表和一個NTC空白對照進(jìn)行比較，每個位點(diǎn)理論上存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點(diǎn)三種不同的基因型；

(1)、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP1)SEQ?ID?NO1：Val762Ala

在檢測結(jié)果圖中，共有21-31個點(diǎn)，每個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，X坐標(biāo)軸0.4-0.5、Y坐標(biāo)軸：0.2-0.4區(qū)域?yàn)榭瞻讓φ铡坐標(biāo)軸：0.2-0.4、Y坐標(biāo)軸：1.0-1.3區(qū)域?yàn)門T基因型、X坐標(biāo)軸：0.7-0.9、Y坐標(biāo)軸：0.7-1.0區(qū)域?yàn)門C基因型、X坐標(biāo)軸：0.8-0.9、Y坐標(biāo)軸：0.3-0.4區(qū)域?yàn)镃C基因型，其中，CC為風(fēng)險基因型，攜帶風(fēng)險基因型時酶的活性降低，導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生風(fēng)險增加；

(2)、人類X射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)SEQ?ID?NO2：Arg194Trp

在檢測結(jié)果圖中，共有21-31個點(diǎn)，每個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，X坐標(biāo)軸：0.1-0.2、Y坐標(biāo)軸：0.2-0.3區(qū)域?yàn)榭瞻讓φ?、X坐標(biāo)軸：0.1-0.2、Y坐標(biāo)軸：0.9-1.1區(qū)域?yàn)镃C基因型、X坐標(biāo)軸：0.3-0.5、Y坐標(biāo)軸：0.75-0.95區(qū)域?yàn)門C基因型、X坐標(biāo)軸：0.5-0.6、Y坐標(biāo)軸：0.5-0.6區(qū)域?yàn)門T基因型，其中，TT為風(fēng)險基因型，攜帶風(fēng)險基因型時XRCC1活性降低，導(dǎo)致個體的DNA修復(fù)能力下降，癌癥的發(fā)生風(fēng)險增加；

(3)、人類X射線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)SEQ?ID?NO3：Arg399Gln

在檢測結(jié)果圖中，共有21-31個點(diǎn)，每個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，X坐標(biāo)軸：0.1-0.2、Y坐標(biāo)軸：0.3-0.4區(qū)域?yàn)榭瞻讓φ铡坐標(biāo)軸：0.1-0.2、Y坐標(biāo)軸：2.1-2.2區(qū)域?yàn)門T基因型、X坐標(biāo)軸：0.4-0.6、Y坐標(biāo)軸：1.1-1.7區(qū)域?yàn)門C基因型、X坐標(biāo)軸：0.8-1.0、Y坐標(biāo)軸：0.4-0.5區(qū)域?yàn)镃C基因型，其中，TT為風(fēng)險基因型，攜帶風(fēng)險基因型時個體的DNA修復(fù)能力下降，癌癥的發(fā)生風(fēng)險增加；

(4)、切除修復(fù)復(fù)合物2(ERCC2)SEQ?ID?NO4：Lys7516ln

在檢測結(jié)果圖中，共有21-31個點(diǎn)，每個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，X坐標(biāo)軸：0.0-0.1、Y坐標(biāo)軸：0.2-0.3區(qū)域?yàn)榭瞻讓φ?、X坐標(biāo)軸：0.05-0.15Y坐標(biāo)軸：1.5-2.0區(qū)域?yàn)锳A基因型、X坐標(biāo)軸：0.7-0.9、Y坐標(biāo)軸：1.4-1.6區(qū)域?yàn)锳G基因型、X坐標(biāo)軸：0.7-1.2、Y坐標(biāo)軸：0.3-0.5區(qū)域?yàn)镚G基因型，其中，AA和AG為風(fēng)險基因型，攜帶風(fēng)險基因型時基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物不能正確識別DNA損傷位點(diǎn)，DNA上致癌損傷積累，癌癥的發(fā)生風(fēng)險增加；

(5)、切除修復(fù)復(fù)合物2(ERCC2)SEQ?ID?NO5：Asn312Asp

在檢測結(jié)果圖中，共有21-31個點(diǎn)，每個點(diǎn)代表一個被測者樣本的檢測結(jié)果，X坐標(biāo)軸：0.1-0.2、Y坐標(biāo)軸：0.4-0.5區(qū)域?yàn)榭瞻讓φ铡坐標(biāo)軸：0.0-0.1、Y坐標(biāo)軸：2.3-2.8區(qū)域?yàn)門T基因型、X坐標(biāo)軸：0.8-0.1、Y坐標(biāo)軸：2.2-2.5區(qū)域?yàn)镚T基因型、X坐標(biāo)軸：0.8-1.0、Y坐標(biāo)軸：0.4-0.5區(qū)域?yàn)镚G基因型，其中，GT和GG為風(fēng)險基因型，攜帶風(fēng)險基因型時ERCC2參與構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物性能弱化，癌癥的發(fā)生風(fēng)險增加；

每一個被測者的5個點(diǎn)落在5個表上哪個區(qū)域，即可知道被測者DNA損傷修復(fù)能力的遺傳風(fēng)險；

步驟5，根據(jù)檢測結(jié)果給予個性化指導(dǎo)建議，主要有以下幾點(diǎn)：

一、避免過多、過強(qiáng)的紫外線照射：陽光中適量的紫外線照射對人體有益，但過多、過強(qiáng)的紫外線，尤其是紫外線燈等的照射，會引起胸腺嘧啶二聚體的形成，還可以引起DNA之間的交聯(lián)，DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，甚至DNA鏈的斷裂。紫外線對人的傷害主要限于皮膚；

二、避免電離輻射引起的基因損傷：電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化，如：堿基變化、脫氧核糖變化、DNA鍵斷裂、DNA鏈交聯(lián)等。這些輻射可能會引起癌癥的發(fā)生。電離輻射廣泛存在于人們的生活環(huán)境中，包括天然輻射和人造輻射。在日常生活中，應(yīng)注意盡量避免接觸含有放射性物質(zhì)的東西，如夜光手表等；

三、注意防止烷化劑引起的DNA損傷：烷化劑種類很多，如芥子氣、硫酸二乙酯等。很多烷化劑都是致癌物?，F(xiàn)在工業(yè)中大量使用烷化劑，應(yīng)盡量避免接觸。烷化劑引起的損傷有堿基烷基化、堿基脫落、DNA斷鏈、DNA鏈交聯(lián)等；

四、戒煙酒并注意營養(yǎng)補(bǔ)充：吸煙和飲酒會抑制DNA的修復(fù)，缺乏葉酸會增加DNA雙鏈打開的可能性，而這不容易修復(fù)，往往造成DNA永久的損傷。在日常生活中，應(yīng)注意多補(bǔ)充富含各種營養(yǎng)元素的新鮮水果蔬菜及菜花、酵母等富含葉酸的食物。