[發明專利]一種播散肝癌細胞的分離和鑒定方法

無效

• 申請號: 200810040191.9
• 申請日: 2008-07-03
• 公開（公告）號: CN101302495A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 殷正豐;徐文;康曉燕
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;G01N33/577;G01N33/48
• 代理公司: 上海金盛協力知識產權代理有限公司
• 代理人: 沈其梅

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種播散肝癌細胞的分離和鑒定方法。

背景技術

腫瘤轉移是一個多階段、多步驟的復雜過程。存在于原發瘤和轉移瘤之外的腫瘤細胞統稱為播散腫瘤細胞(Disseminated?tumor?cell，DTC)，亦稱游離腫瘤細胞(Isolated?tumorcell，ITC)，包括淋巴結、骨髓和血液等組織中的單個或小簇腫瘤細胞。其中進入血流的又稱循環腫瘤細胞(Circulating?tumor?cell，CTC)。

原發性肝細胞癌是我國最常見、多發的惡性腫瘤之一。盡管近年來治療手段不斷增加，但并沒有從根本上改變肝癌高死亡率的狀況。究其原因，轉移復發率高是影響肝癌遠期療效的主要因素。肝癌細胞可以在很早期播散，大多通過血液和淋巴系統轉移，甚至播散到胸水，腹水等體液中。因此，播散肝癌細胞檢測可以作為肝癌早期診斷的一個標記物、作為肝癌細胞隱匿播散的一個確鑿證據以及作為監測療效和預測復發的一個獨立指標。

以往通常采用RT-PCR檢測白蛋白和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)mRNA來檢測血循環中肝癌細胞，但RT-PCR法有其固有局限，如特異性不高、操作復雜、不能估算樣本中腫瘤細胞的數目等。此外，更不可忽視的是，RT-PCR法須破壞細胞形態，不能對單個腫瘤細胞進行觀察、分析和計數，而這些數據可提供CTC惡性程度和侵襲性方面的信息。故創建行之有效的播散肝癌細胞分離/檢測系統，直接對分離到的播散肝癌細胞進行鑒定、分析和計數，對于進一步提高肝癌的診斷水平乃至治療效果無疑具有重要意義。

目前常用的播散腫瘤細胞分離方法是利用單克隆抗體識別帶有特異表面標記的腫瘤細胞，包括流式細胞儀和免疫磁珠細胞分選技術。前者儀器昂貴，費用很高，技術復雜，經常會被所分選細胞的容量、活性、無菌度等問題所困擾，并且也不能提供有關細胞形態學方面的信息。后者只要是具有特異性表面標記的細胞，不論其含量高低均可以得到分離或富集，不僅細胞處理量大(可達10⁹以上)，分離純度高(可達95％-99.9％)，而且易于獲得無菌的細胞制劑。目前這一技術在腫瘤學研究上更多的是利用上皮細胞單克隆抗體來富集外周血上皮細胞，進而應用RT-PCR等分子生物學方法或流式細胞術鑒定上皮類腫瘤細胞。遺撼的是，由于缺乏相應的肝癌細胞表面抗體，迄今鮮見上述兩種方法用于分選播散肝癌細胞。雖然從理論上講上皮細胞抗體磁珠也可被用來分選屬于上皮類的肝癌細胞，但是這些抗體通常只能識別部分肝癌細胞。比如：上皮細胞抗體Ber-EP4單抗只能識別約67％的肝癌細胞(Latza?Uet?al.Ber-EP4：new?monoclonal?antibody?which?distinguishes?epithelia?frommesothelial[J].J?Clin?Pathol，1990，43(3)：213-9.)。

Ashwell和Morell于20世紀60年代發現，哺乳動物的肝實質細胞膜表面存在一種肝結合蛋白——去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein?receptor，ASGPR)，又稱半乳糖受體(Morell?AG?et?al.Physical?and?chemical?studies?on?ceruloplasmin.V.Metabolicstudies?on?sialic?acid-free?ceruloplasmin?in?vivo[J].J?Biol?Chem，1968，243(1)：155-159.)。ASGPR是一種跨膜蛋白，其胞外區含有糖識別區(carbohydraterecognition?domain，CRD)，能專一性識別和結合以半乳糖殘基和N-乙酰半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白(配體)。ASGPR主要表達于哺乳動物肝竇狀隙的肝實質細胞表面，密度很高，每個肝細胞表面可多達500,000個受體。這一特性已被用于設計多種實驗研究，比如，利用放射性核素標記這樣的糖蛋白進行肝顯像；而以這樣的糖蛋白為載體介導基因或藥物導向肝實質細胞，則是肝靶向治療領域的一個研究命題。但至今未有基于ASGPR來分離播散肝癌細胞的報道。

因此，本領域迫切需要開發出敏感、特異、高效和簡便的播散肝癌細胞分離方法和檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種肝癌細胞的分離和鑒定方法，以及本發明方法所分離到的肝癌細胞。