[發明專利]一種播散肝癌細胞的分離和鑒定方法

無效

• 申請號: 200810040191.9
• 申請日: 2008-07-03
• 公開（公告）號: CN101302495A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 殷正豐;徐文;康曉燕
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;G01N33/577;G01N33/48
• 代理公司: 上海金盛協力知識產權代理有限公司
• 代理人: 沈其梅

1.一種肝癌細胞的分離方法，其特征在于，包括下述步驟：

(a)采集樣品；

(b)從樣品中分離單個核細胞；

(c)以與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結合，所述物質A與磁珠間接連接，形成復合物B；

(d)磁性分離步驟(c)中的復合物B。

2.權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述物質A選自ASGPR的配體或抗體。

3.權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(b)中采取的分離方法為密度梯度細胞分離法。

4.權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。

5.權利要求4所述的分離方法，其特征在于，所述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。

6.權利要求2所述的分離方法，其特征在于，所述物質A為ASGPR的配體，所述ASGPR的配體為可與ASGPR的糖識別區(CRD)特異結合的蛋白、糖、多肽或核酸。

7.權利要求6所述的分離方法，其特征在于，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以半乳糖殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白。

8.權利要求7所述的分離方法，其特征在于，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為去唾液酸胎球蛋白。

9.權利要求2所述的分離方法，其特征在于，所述物質A為ASGPR胞外區的抗體。

10.權利要求9所述的分離方法，其特征在于，所述ASGPR胞外區的抗體為單克隆抗體。

11.權利要求1-8任一權利要求所述的肝癌細胞的分離方法，其特征在于，所述物質A為ASGPR的配體，所述步驟(c)的具體步驟為：

(f)先以ASGPR的配體-生物素與單個核細胞中的肝癌細胞結合形成復合物1；

(g)再以C-磁珠與復合物1結合，形成復合物B1；

所述C為與生物素特異結合的物質。

12.權利要求11所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(f)中ASGPR的配體為去唾液酸胎球蛋白；C為鏈霉親和素或生物素抗體。

13.權利要求12所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃度為0.1-0.8mg/ml。

14.權利要求13所述的肝癌細胞的分離方法，其特征在于，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃度為0.4-0.8mg/ml。

15.權利要求1-5、9-10任一權利要求所述的肝癌細胞的分離方法，其特征在于，所述物質A為ASGPR抗體，所述步驟(c)的具體步驟為：

(h)先以ASGPR抗體與肝癌細胞結合形成復合物3；

(I)再以二抗-磁珠與復合物3結合，形成復合物B3。

16.權利要求15所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR抗體為小鼠抗人ASGPR單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。

17.權利要求16所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反應濃度為0.1-5μg/ml。

18.權利要求17所述的肝癌細胞的分離方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反應濃度為2-4μg/ml。

19.權利要求1-10、12-14、16-18任一權利要求所述的分離方法所分離的肝癌細胞。

20.一種肝癌細胞的鑒定方法，其特征在于，包括下述步驟：

(a)采集樣品；

(b)從樣品中分離單個核細胞；

(c)以與去唾液酸糖蛋白受體特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結合，所述物質A與磁珠間接連接，形成復合物B；

(d)磁性分離步驟(c)中的復合物B；

(e)檢測鑒定肝癌細胞是否存在。

21.權利要求20所述的鑒定方法，其特征在于，所述物質A選自ASGPR的配體或抗體。