[發明專利]一種篩選激活潛伏感染HIV－1化合物的T淋巴細胞及其制備方法

有效

• 申請號: 200810038851.X
• 申請日: 2008-06-12
• 公開（公告）號: CN101372707A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發明（設計）人: 朱煥章;辛清婷;劉紹輝;唐麗莎;余龍
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/68;C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 姚靜芳

技術領域

本發明屬于基因工程和細胞工程領域，涉及一種用于篩選再次激活潛伏感染HIV-1化合物的人T淋巴細胞系模型及其制備方法。?

背景技術

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由HIV感染引起的一種嚴重危害人們生命健康的傳染性疾病。據WHO統計全球艾滋病患者已超過4000萬，每年新增患者500萬，而每年死亡約為300萬。目前，艾滋病臨床治療方法主要是高效抗逆傳錄病毒療法(Highly?active?antiretroviral?therapy，HAART)，由于它能有效減少病毒載量(virus?load)和保護免疫功能，從而相應地延長了HIV感染者的存活時間。然而，該療法只能抑制病毒復制，不能徹底清除HIV的感染，大多數病人在中斷HAART后會出現病毒反彈，其主要原因是HIV會整合在靜止型記憶細胞CD4陽性T細胞的基因組中。這些細胞半衰期較長，據估計，機體要清除這些病毒儲存庫的細胞需要40-60年。最近，免疫刺激治療的策略可通過對感染細胞的再次激活，從而促進細胞死亡以此加速病毒庫的清除，因而，該策略為病毒儲存庫的控制開辟了新的思路。盡管對病毒儲藏庫的消除已有幾個方案，但在臨床上仍未獲得滿意的效果，因此，研發新型激活潛伏感染細胞藥物已是迫在眉睫，而建立相應藥物篩選模型是一個關鍵環節。?

發明內容

本發明的目的是提供一種用于篩選再次激活潛伏感染HIV-1化合物的人T淋巴細胞。?

本發明的另一個目的是提供上述細胞的制備方法。?

本發明的再一個目的是提供上述細胞的應用。?

HIV分為HIV-1和HIV-2兩個型。目前廣泛流行于全球的毒株是HIV-1型。HIV-2毒株雖然發現于西非地區，隨著時間的推移，該毒株在歐洲、美國和南美、亞洲一些感染者中也被檢測到，尤其亞洲印度的HIV-2感染者數量正在迅速增加，我國在新疆、上海等地區也已陸續發現。當然不論從全球乃至我國，HIV-1是當前主要的艾滋病流行毒株。若要獲得有效安全的再次激活潛伏感染HIV-1化合物，就必須大規模在于HIV-1潛伏的細胞模型上進行篩選。由于HIV-1潛伏的靜止型記憶CD4細胞數量較少，且其形態上與正常CD4細胞一樣，分離純化和鑒定病毒儲存庫的細胞較難，因而，以患者HIV-1潛伏的感染細胞為藥物篩選模型較困難。為此，本發明將攜帶EGFP報告基因的HIV-1的慢病毒感染人淋巴細胞系，模擬HIV-1感染正常人T淋巴細胞的狀況，通過細胞分選，獲得不表達的細胞并進行克隆擴增，對這些克隆進行HIV整合檢測，然后，獲得具有HIV整合但未表達EGFP的克隆。為了驗證該細胞模型的可用性，我們利用TNF-α進行誘導，最后獲得誘導性的EGFP表達克隆，該基因修飾細胞系即為潛伏感染HIV-1的人T淋巴細胞模型，該模型將為HIV-1潛伏的機制研究，尤其是為病毒儲藏庫控制藥物的篩選奠定基礎。?

本發明提供了一種篩選激活潛伏感染HIV-1藥物的T淋巴細胞，該細胞是被攜帶報告基因的HIV慢病毒感染同時又不表達Jurkat穩定株。?

本發明所述Jurkat穩定株已經提交中國典型培養物保藏中心(中國武漢.武漢大學)保藏，保藏號為CCTCC?NO.C200821，名稱為Jurkat-LTRGT細胞系，保藏日期為2008年5月19日。?

本發明提供了一種基于HIV-1慢病毒包裝載體系統，由FGW質粒、CMVΔ8.9和包膜質粒VSVG組成(其結構示意圖分別如圖1、2和3所示)組成..?

本發明的FGW質粒是在FUGW慢病毒載體基礎上，經過基因缺失泛素調控區改建而成。FUGW，CMVΔ8.9和包膜質粒VSVG來源于美國Carlos?Lois博士惠贈。FUGW來源于文章：Lois?C，et?al.Germline?transmission?and?tissue-specificexpression?of?transgenes?delivered?by?lentiviral?vectors.Science，2002，295：868-72。FGW質粒是由FUGW衍生的、已除去HIV-1有害基因后的HIV長末端重復序列(LTR)及FLAP作為骨架，表達僅由LTR調控的綠色熒光蛋白基因(EGFP)；?pCMV.Δ8.9為包裝結構質粒，主要起病毒包裝功能，表達酶蛋白形成病毒衣殼結構及整合酶(IN)；VSVG為包膜質粒。?

本發明所述的藥物可以是人工合成，也可以是從植物中提取。?