[發(fā)明專利]一種檢測石蠟標本DNA甲基化的方法有效

申請?zhí)枺?/td>	200810038455.7	申請日：	2008-06-03
公開（公告）號：	CN101285097A	公開（公告）日：	2008-10-15
發(fā)明（設計）人：	衛(wèi)立辛;張春東;蔣國成;程越;郭獻靈;吳孟超	申請（專利權）人：	中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68
代理公司：	上海德昭知識產權代理有限公司	代理人：	丁振英
地址：	200135***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種檢測石蠟標本 dna 甲基化方法
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【說明書】：

技術領域：

本發(fā)明涉及醫(yī)學生物學檢測技術領域，具體是一種檢測石蠟標本DNA甲基化的方法。

背景技術：

DNA甲基化異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。近年來有關DNA甲基化與腫瘤發(fā)生的關系日益受到人們的重視，成為腫瘤分子生物學研究熱點之一。DNA甲基化的主要研究方法有甲基化特異性PCR。

以往實驗多采用新鮮組織，研究樣本來源有很大的局限性，而石蠟標本來源豐富，而且可以針對新課題做回顧性分析，彌補了新鮮組織標本存在的取材不易及保存困難等缺點，為臨床和科研提供了有利的幫助，因此大大的方便了實驗研究。

傳統(tǒng)的從石蠟標本中制備檢測DNA甲基化的方法，主要過程如下：

1、制備待測DNA：

1)脫蠟：將石蠟標本切片用二甲苯脫蠟2次，再用無水乙醇洗滌2次，組織干燥后，用基因組DNA抽提試劑盒制備DNA；

2)細胞裂解：加裂解液，在55℃下用蛋白酶K消化12-24小時；

3)抽提DNA：用酚氯仿抽提兩次；

4)沉淀DNA：用無水乙醇沉淀，70％酒精洗滌，涼干備用。

2、DNA亞硫酸氫鈉修飾：

1)DNA解鏈：將上述制備的DNA變性，成為單鏈DNA，使堿基充分暴露；

2)DNA亞硫酸氫鈉修飾：將上述單鏈DNA與亞硫酸氫鈉反應，使DNA單鏈上未甲基化的胞嘧啶被修飾成磺化胞嘧啶，脫氨基，該磺化胞嘧啶變?yōu)榛腔蜞奏ぃ欢?’-甲基化胞嘧啶不能被修飾；

3)脫磺化：將修飾后的DNA產物經過透析脫鹽，用氫氧化鈉脫磺化，使得磺化尿嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃ嗉丛瓉頉]有甲基化的胞嘧啶堿基變?yōu)槟蜞奏ぃ欢谆陌奏げ蛔儭?/p>

3、純化：

上述修飾的DNA用酒精沉淀、洗滌，用作PCR模板。

4、PCR擴增和檢測分析：將純化的DNA修飾產物溶解于TE，用設計的待測基因的正、反向甲基化特異性引物和未甲基化特異性引物進行PCR擴增。將PCR擴增產物與標準品進行凝膠電泳檢測或DNA測序分析，就可確定該基因的胞嘧啶甲基化程度。如果其中多數基因發(fā)生異常甲基化，則就提示該患者可能得相應的癌癥。

具體步驟主要為：

1、制備待測DNA：按常規(guī)方法脫蠟和從組織中抽提DNA。

2、DNA亞硫酸氫鈉修飾：

1)、取1μg?DNA，溶于20μl水中，95℃水浴10分鐘；立即放于冰浴；加入2μl?10M氫氧化鈉，使DNA變性，成為單鏈DNA；

2)、加入亞硫酸氫鈉修飾液230μl(3M亞硫酸氫鈉，10mM氫醌，PH5.0)；置于55℃避光修飾16小時，DNA被修飾，未甲基化的胞嘧啶被修飾為磺化尿嘧啶。

3.DNA修飾產物的純化：

1)將上述DNA修飾產物在4℃下用雙蒸水透析過夜，去除多余的亞硫酸氫鈉；

2)脫磺化：加入10M?NaOH使其終濃度為0.3M，室溫20分鐘；再加入等當量的1M鹽酸中和NaOH，磺化尿嘧啶脫磺化后成尿嘧啶；

3)沉淀：加入四分之一體積的10M醋酸銨和2倍體積乙醇，將DNA修飾產物置于-20℃沉淀過夜；

4)洗滌：13000rpm離心10分鐘，棄上清，用70％酒精洗滌2次；干燥10分鐘，得純化的DNA修飾產物，亦即PCR模板。

4.PCR擴增和檢測分析：

將純化的DNA修飾產物溶解于20μlTE，用設計的待測基因的正、反向甲基化特異性引物和未甲基化特異性引物進行PCR擴增。