[發明專利]一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法

有效

• 申請號: 200810037734.1
• 申請日: 2008-05-20
• 公開（公告）號: CN101280307A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 陳宇光;徐佳;沈彥萍
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 上海上大專利事務所
• 代理人: 何文欣

技術領域

本發明涉及一種果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的制備方法，特別是一種采用基因工程法制備果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的方法。

發明背景

20世紀30年代，隨著Fleming發現青霉素之后，各種天然、合成、半合成的抗生素開始被應用于抵抗各種微生物的感染，廣泛使用在藥物、動物飼料等領域。此后的幾十年，抗生素對保護人類健康做出了巨大貢獻。但是，隨著它的長期大量應用，人們發現了多種產生耐藥性的菌株，導致一些過去可以被抗生素有效控制的傳染性疾病死灰復燃。抗感染治療再度陷入危機，使得尋找抗生素替代品成了亟需解決的問題。

抗菌肽(Antibacterial?Peptide)作為一種具有抗感染活性的多肽類物質，具有以下特性：性能穩定，抗菌譜廣泛，不易產生耐藥性和生理抵制作用。因此，抗菌肽越來越多地受到人們的關注，有望成為替代抗生素的藥物。

果蠅缺乏哺乳動物所具有的獲得性免疫系統，即體內沒有T細胞和B細胞，也沒有抗體和補體系統。但是成蟲果蠅卻能成為酵母、細菌和真菌的傳播載體，使有機體腐爛或變壞，這主要是因為果蠅具有天然的免疫系統，可以抵制各種病原微生物的侵染。果蠅免疫反應的一個重要特點就是在受到病原微生物侵染或損傷時，脂肪體細胞能快速合成一些抗菌肽，這些分子分泌到血淋巴后能殺死入侵的病原微生物。伏蠅素Diptericin就是其中的一個重要成員，它對革蘭氏陰性菌具有較強殺菌作用，推測其殺菌機制可能是增加了革蘭氏陰性菌細胞質內β-半乳糖苷酶的釋放，從而增加內膜和外膜的通透性，阻礙了細菌的生長。

目前抗菌肽的生產主要有以下渠道：直接提取純化、化學合成以及通過基因工程合成的方法合成，但是，從生物體內直接提取的難度大，對技術和成本的要求高，難以實現規模化生產，化學合成法費用昂貴，限制了應用。因此，基因重組技術成為大量表達有活性抗菌肽的一條有效途徑。

大腸桿菌的原核表達系統是迄今在基因工程領域中應用最多、也最完善的系統，但是，運用該系統表達抗菌肽則遇到了很多困難，主要表現在：1)抗菌肽對宿主細胞的毒性。陽性抗菌肽的抑菌作用會對宿主細胞產生抑制，從而影響抗菌肽的進一步表達。2)容易被降解。由于抗菌肽分子量小，本身帶有大量正電荷，因而對蛋白酶非常敏感，在表達細胞中容易被降解，難以實現大量表達。因此，本發明選用融合表達載體pGEX-4T-1，該載體本身含有編碼GST蛋白的序列，使表達出的抗菌肽N端融合一段GST序列，起到以下三個作用：1)增加外源蛋白的穩定性；2)提高外源基因在宿主中的表達水平；3)有利于目的蛋白的分離純化。

發明內容

本發明的目的在于提供一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因：提取果蠅總RNA，然后以果蠅總RNA為模板，根據果蠅diptericin基因序列設計特異性引物：

上游引物D1：5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；

下游引物D2：5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；

然后進行PCR擴增得到280bp的diptericin片段；

b.重組質粒pGEX-4T-1-diptericin的構建：將用EcoR?I和Xho?I雙酶切后的diptericin片斷插入質粒pGEX-4T-1的EcoR?I/Xho?I之間，構成重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin；轉化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆；抽提質粒，用EcoR?I和Xho?I雙酶切，得到280bp左右的片段，即為重組質粒pGEX-4T-1-diptericin；

c.融合蛋白的表達純化和伏蠅素Diptericin的獲得：將上述的重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養基中培養至OD600值達到0.6，加入100mM?IPTG儲液至終濃度為1.0mM；繼續培養4小時后離心，收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，離心收集上清，進行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應16小時，終止反應，再次進行親和層析，收集流出組分，冷凍干燥，得到果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin。

與現有技術相比，本發明具有如下顯而易見的特點和顯著優點：