[發明專利]一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法

有效

• 申請號: 200810037734.1
• 申請日: 2008-05-20
• 公開（公告）號: CN101280307A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 陳宇光;徐佳;沈彥萍
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 上海上大專利事務所
• 代理人: 何文欣

1.一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因：提取果蠅總RNA，然后以果蠅總RNA為模板，根據果蠅diptericin基因序列設計特異性引物：

上游引物D1：5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；

下游引物D2：5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；

然后進行PCR擴增得到280bp的diptericin片段；

b.重組質粒pGEX-4T-1-diptericin的構建：將用EcoR?I和Xho?I雙酶切后的diptericin片斷插入質粒pGEX-4T-1的EcoR?I/Xho?I之間，構成重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin；轉化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆；抽提質粒，用EcoR?I和Xho?I雙酶切，得到280bp左右的片段，即為重組質粒pGEX-4T-1-diptericin；

c.融合蛋白的表達純化和伏蠅素Diptericin的獲得：將上述的重組表達質粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養基中培養至OD600值達到0.6，加入100mM?IPTG儲液至終濃度為1.0mM；繼續培養4小時后離心，收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，離心收集上清，進行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應16小時，終止反應，再次進行親和層析，收集流出組分，冷凍干燥，得到果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin。