[發(fā)明專利]一種星形孢菌素提取純化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810037512.X
• 申請(qǐng)日: 2008-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN101580515A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡海峰;張海紅;張琴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
• 主分類號(hào): C07D498/22
• 分類號(hào): C07D498/22;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 薛 琦;朱水平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種星形孢菌素提取純化的方法。

背景技術(shù)

星形孢菌素(staurosporine，以下簡稱STS)一種廣譜非特異性蛋白激酶C抑制劑，可強(qiáng)有力地抑制蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)。可用于抵抗酵母和真菌引起的許多感染性疾病，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，廢除細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，抑制血管增生等。還具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性，在臨床上對(duì)12種人腫瘤細(xì)胞平均IC₅₀為0.016μg/ml(U.S.Patent?4735039)。另外，STS的衍生物UCN-01等作為抗腫瘤藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床二期(EP?0?238?011?B1，EP?0?575?955?A1)。

U.S.Pat.No.4,107,297描述了從放線菌AM-2282發(fā)酵液中提取STS的工藝。方法為：發(fā)酵液用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH10.0，再用乙酸丁酯萃取，乙酸丁酯相轉(zhuǎn)移到0.1N鹽酸中，萃取后，用氨水調(diào)節(jié)水相pH為10.0，然后用乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取相加入無水硫酸鈉干燥，然后真空濃縮，硅膠柱(Merk，Kieselgel?G)層析分離，洗脫劑為氯仿∶甲醇(60∶1，v/v)，生物堿跟碘化鉍鉀發(fā)生顏色反應(yīng)，利用薄層層析檢測(氯仿∶甲醇＝10∶1)。收集生物堿部分，并真空濃縮干燥得到淡黃色粉末。粉末利用氯仿∶甲醇(50∶1，v/v)重結(jié)晶得到淡黃色針狀晶體。該工藝操作復(fù)雜，收率很低，最終獲得的產(chǎn)品很少。

Morioka等描述了從發(fā)酵液中提取STS的工藝(參考文獻(xiàn)：Morioka，H.，Ishihara，M.，Shibai，H.&?Suzuki，T.Staurosporine-induced?differentiation?in?ahuman?neuroblastoma?cell?line，NB-1.Agric.Biol.Chem.1985，49，1959-1963)。

發(fā)酵液離心，濾餅用甲醇萃取，萃取液真空濃縮，濃縮物用乙酸乙酯萃取，然后上兩次硅膠柱層析純化，兩次重結(jié)晶，得到STS。此方法操作容量有限，耗時(shí)多，收率低，也不適應(yīng)于生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的星形孢菌素提取純化的方法存在的高純度和高收率不能兼得的不足，提供一種不但產(chǎn)品純度高，而且收率也較高的星形孢菌素提取純化的方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種星形孢菌素提取純化的方法，可包含以下步驟：

1)將星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體的親水性有機(jī)溶劑或親水性有機(jī)溶劑的水溶液提取液除去有機(jī)溶劑后加入酸溶液至酸性，然后離心、取上清；

2)上清在堿性條件下用親脂性有機(jī)溶劑萃取；

3)萃取液濃縮后，進(jìn)行硅膠柱層析。

根據(jù)本發(fā)明，步驟1)將星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體的親水性有機(jī)溶劑或親水性有機(jī)溶劑的水溶液提取液除去有機(jī)溶劑后加入酸溶液至酸性，然后離心、取上清。所述的提取液較佳的為星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體在堿性條件下用親水性有機(jī)溶劑或親水性有機(jī)溶劑的水溶液提取所得，此步驟可采用現(xiàn)有技術(shù)，如上述Morioka的工藝。其中，所述的堿性條件為pH?8.0～14.0，較佳的為pH?10.0～13.0，更佳的為pH?12.0，可以加入氨水或氫氧化鈉達(dá)到上述堿性條件。星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體較佳的可由星形孢菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵液離心而得，通常選用濕菌體即可。提取時(shí)采用的親水性有機(jī)溶劑或親水性有機(jī)溶劑的水溶液的用量較佳的為星形孢菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵液體積的0.5倍以上，或者其用量可以使星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體在其中的濃度不超過1g/ml。所述的親水性有機(jī)溶劑較佳的可選自醇、酮和四氫呋喃。所述的醇較佳的為C_1-3的低級(jí)脂肪醇，更優(yōu)選自甲醇和乙醇。所述的酮較佳的為丙酮。所述的親水性有機(jī)溶劑的水溶液較佳的可為85～100％甲醇水溶液、85～100％乙醇水溶液或85～100％丙酮水溶液，更佳的可為90％的甲醇水溶液、90％的乙醇水溶液或95％的丙酮水溶液，上述百分比為重量百分比。所述提取液更佳的可以是星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體在堿性條件下用親水性有機(jī)溶劑或親水性有機(jī)溶劑的水溶液提取兩次或多次所得。該提取液在除去其中的親水性有機(jī)溶劑后加入酸溶液至酸性，所述酸溶液較佳的可選自鹽酸和草酸，優(yōu)選0.1N鹽酸。所述酸性較佳的為pH?1～5，優(yōu)選pH2～3。