[發(fā)明專利]一種豬骨髓內(nèi)皮祖細胞的分離和培養(yǎng)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810037324.7
• 申請日: 2008-05-13
• 公開（公告）號: CN101265464A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設計）人: 方國恩;周虹;羅天航;吳建國;盧正茂;毛岸榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 上海德昭知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 丁振英

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，具體地說，涉及一種豬骨髓內(nèi)皮祖細胞的分離和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

隨著20世紀末期以來干細胞技術(shù)和理論迅猛發(fā)展，創(chuàng)傷引起的缺血性疾病以及創(chuàng)傷修復機制的研究和臨床治療面臨著新的契機。研究表明：機體損傷后，血循環(huán)中具有多向分化潛能的干/祖細胞一方面可以在炎癥細胞產(chǎn)生的細胞因子/生長因子作用下動員、增殖、遷徙入損傷器官，分化為相應的組織細胞進行損傷修復，另一方面，遷徙到損傷部位的干細胞還可以對不同的局部刺激(包括缺氧或缺血)作出生理反應，依次釋放血管活性物質(zhì)、生長因子以及參與免疫調(diào)節(jié)的細胞因子和趨化因子，參與創(chuàng)傷后的炎癥反應。

研究表明，內(nèi)皮細胞不僅是炎癥反應的參與者，還是首先受損的靶細胞，并進而造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，這可能是創(chuàng)傷后器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。1997年，Asahara等首先從外周血單個核細胞(PBMCs)里分離出一種被稱為內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的祖細胞亞群，這些細胞具有在體內(nèi)外增殖、遷徙和分化為成熟內(nèi)皮細胞的能力。血循環(huán)中的EPC主要來源于骨髓，另外，循環(huán)中的多能干細胞也可以在細胞因子刺激下分化為EPC。目前認為，外周血中的EPC包含有兩種形式：即剛被動員進入血循環(huán)早期EPC，它們都表達三種祖細胞分子標志：CD133、CD34和血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)，之后循環(huán)中EPC則逐漸失去CD133表型和祖細胞特性，并開始表達內(nèi)皮系的特征性分子標志：血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1(CD31)和VIII因子(vWF)，從而分化為晚期EPC。

體外實驗中，兩種EPC都可以攝取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)，并結(jié)合內(nèi)皮特異性植物血凝素(lectin)，這成為體外鑒定EPC的特異性表型。Hill等通過對外周血EPC體外培養(yǎng)后集落形成單位計數(shù)，來間接測定循環(huán)中EPC的數(shù)量，并認為內(nèi)皮損傷后循環(huán)中EPC的水平可以影響心血管疾病的進程。大量的動物和臨床實驗都已經(jīng)證明：當組織受到損傷時，尤其是缺血性損傷時，循環(huán)及組織中EPC動員和增殖能力增強，并可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細胞替換功能障礙的內(nèi)皮細胞、修補裸露的血管內(nèi)皮損傷區(qū)，并參與缺血或損傷組織內(nèi)新血管生成，從而改善缺血器官的功能；而如果創(chuàng)傷后EPC的分化、遷徙功能發(fā)生嚴重障礙，則會導致?lián)p傷部位微循環(huán)嚴重損害而無法得到修復，甚至發(fā)生器官功能衰竭。

在以前的實驗和臨床研究表明，肌肉內(nèi)注射VEFG表達質(zhì)粒能促進缺血組織新生血管的形成，Iwaguro發(fā)現(xiàn)給患者肌肉注射VEGF表達質(zhì)粒后循環(huán)血中內(nèi)皮祖細胞增加了219％，提示增加的內(nèi)皮祖細胞對新生血管的形成有關。他們收集健康成人的外周血單核細胞，在含有VEGF、bFGF、IGF、EGF的培養(yǎng)基里，7-10天后內(nèi)皮祖細胞數(shù)量擴增了90倍。截斷無胸腺裸鼠的單側(cè)股動脈制成后肢缺血模型后心臟內(nèi)注入人內(nèi)皮祖細胞，發(fā)現(xiàn)移植了人內(nèi)皮祖細胞的缺血后肢血流加快，缺血后肢的毛細血管密度顯著增加，缺血造成的肢體壞死和肢體自身斷離都分別減少60％。制成組織切片進行觀察，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞參與了新血管的形成。將VEGF基因轉(zhuǎn)入內(nèi)皮祖細胞再移植，缺血后肢的血管新生進一步得到改善，缺血造成的肢體壞死和肢體自身斷離比對照組減少了1/30。在骨髓移植小鼠皮下接種同系的結(jié)腸癌細胞，1周后發(fā)現(xiàn)腫瘤的新生血管網(wǎng)中有部分供體來源的內(nèi)皮祖細胞，而且，內(nèi)皮祖細胞參與了損傷處新血管的形成。在后肢缺血模型中，發(fā)現(xiàn)骨骼肌新生的毛細血管壁有供體來源的內(nèi)皮祖細胞。永久性結(jié)扎的左前降支冠狀動脈，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞參與心肌梗死邊緣處的新血管形成。以上實驗表明，出生后的新血管形成，不僅僅是現(xiàn)有血管出芽延伸的結(jié)果，骨髓來源的循環(huán)血中的內(nèi)皮祖細胞也發(fā)揮了作用。目前逐漸開始應用EPC于臨床治療肢體缺血疾病。

在正常條件下，循環(huán)系統(tǒng)中EPC僅占單核細胞0.03～0.06％。局部的血管損傷、缺血、燒傷、創(chuàng)傷及細胞因子等均能刺激EPC從骨髓中動員出來，進入血液循環(huán)系統(tǒng)，遷移到損傷內(nèi)皮處。生理學上認為局部缺血是介導EPC從骨髓動員的顯著信號。近年來研究表明EPCs不僅參與胚胎期血管發(fā)生，在生后血管的生理或病理性重建中也發(fā)揮重要作用，特別研究發(fā)現(xiàn)EPCs在腫瘤血管生成過程中起著重要的作用。由于EPC有多種分化潛能，是機體創(chuàng)傷修復過程中不可缺少的組成部分，同時可以幫助恢復和重建動脈粥樣硬化的血管內(nèi)皮功能，防止動脈粥樣硬化的進一步惡化，減少心肌梗死的發(fā)生。除此之外，EPCs還能夠分泌多種促進新生血管生長的因子；如一氧化氮(NO)，EGF，成纖維細胞生長因子-4、9(FGF-4、9)，肝細胞生長因子(HGF)，白介素-8(IL-8)，VEGF等。