[發明專利]一種豬骨髓內皮祖細胞的分離和培養方法

無效

• 申請號: 200810037324.7
• 申請日: 2008-05-13
• 公開（公告）號: CN101265464A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 方國恩;周虹;羅天航;吳建國;盧正茂;毛岸榮
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁振英

1、一種豬骨髓內皮祖細胞的分離和培養方法，其特征在于該方法依次包括下述步驟：

A、取豬髂骨抗凝骨髓5-10ml，用Ficoll密度梯度離心法分離出骨髓中單個核細胞；

B、體外培養單個核細胞：

先將M-199培養液加入裝有細胞的試管混勻后，種于預先包被有纖維連接蛋白的培養瓶/皿中；放入常規細胞培養箱培養2小時后，取出培養皿中的懸浮液，將懸浮液離心，離心條件為4℃，300g，6分鐘；離心后去上清液，將添加高濃度血清和生長因子的M-199培養液加入試管后混勻，將混勻的細胞液二次接種于預先包被有纖維連接蛋白的培養瓶/皿中；放入常規細胞培養箱進行培養；每48-96小時給培養皿內的細胞更換為添加低濃度血清和生長因子的M-199培養液一次；培養7天后，所得的貼壁細胞即為EPC；

所述的添加高濃度血清和生長因子的M-199培養液的配方為：M-199為基礎培養液，20％胎牛血清，重組人EGF?10.0ng/ml，重組bFGF20.0ng/ml，vEGF2.0ng/ml，Long?R3?IGF-140.0ng/ml，氫化可的松200ng/ml，抗壞血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，鏈霉素0.1mg/ml，兩性霉素B?50ng/ml，肝素100U/ml，酚紅0.62ng/ml；

所述的添加低濃度血清和生長因子的培養液的配方為：M-199為基礎培養液，5％胎牛血清，重組人EGF?5.0ng/ml，重組人bFGF?10.0ng/ml，vEGF?0.5ng/ml，Long?R3?IGF-120.0ng/ml，氫化可的松200ng/ml，抗壞血酸1.0μg/ml，青霉素0.1mg/ml，鏈霉素0.1mg/ml，兩性霉素B?50ng/ml，肝素100U/ml，酚紅0.62ng/ml；

C、體外消化傳代擴增EPC；

D、內皮祖細胞鑒定：進行細胞形態學、表型和細胞功能鑒定。

2、根據權利要求1所述的一種豬骨髓內皮祖細胞的分離和培養方法，其特征在于其中的步驟A，具體操作如下：

無菌條件下取小型豬髂骨抗凝骨髓5-10ml，將骨髓細胞移入試管和無菌PBS液1∶1混勻后離心，離心條件為20℃，400g，10分鐘；離心后去上清液，再和無菌的PBS液1∶1混勻；取Ficoll液10ml分兩份加入空白試管；將混勻的骨髓細胞液體緩慢的滴入裝有Ficoll液的試管后離心，離心條件為20℃，900g，30分鐘；離心后，先去除最上層的上清液，將單個核細胞層取出加入空白試管，再加入1∶1無菌PBS液混勻后離心，離心條件為4℃，500g，10分鐘；離心后去上清液，再加入1∶1無菌PBS液混勻后再次離心，離心條件為4℃，300g，10分鐘，所得的即為分離出的單個核細胞，并對分離出的單個核細胞進行計數。

3、根據權利要求1所述的一種豬骨髓內皮祖細胞的分離和培養方法，其特征在于其中的步驟B中所述的單個核細胞種植密度為2×10⁵-5×10⁵個細胞/cm²。

4、根據權利要求1所述的一種豬骨髓內皮祖細胞的分離和培養方法，其特征在于其中的步驟B中所述的纖維連接蛋白包被的濃度為25mg/l，密度為5-10μl/cm²，在4℃環境下，包被時間不少于12小時。

5、根據權利要求1所述的一種豬骨髓內皮祖細胞的分離和培養方法，其特征在于其中的步驟C，具體操作如下：

原代細胞培養7天后，觀察細胞，當貼壁細胞鋪滿整個培養皿的底壁，準備消化傳代；先用PBS×2次洗去未貼壁的細胞，每次2分鐘，貼壁細胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化計數后5×10³-1×10⁴個細胞/cm²的密度再分種于新皿中進行傳代培養，記為P1；以后細胞每培養4d后，觀察細胞，當貼壁細胞鋪滿整個培養皿的底壁，即消化傳代；先用PBS×2次洗去未貼壁的細胞，每次2分鐘，貼壁細胞用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化后5×10³-1×10⁴個細胞/cm²的密度再分種于新皿中進行傳代培養，記為P2；以此類推。