[發明專利]香菇香九菌種的分子標記、其檢測方法與應用

無效

• 申請號: 200810037261.5
• 申請日: 2008-05-09
• 公開（公告）號: CN101265494A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 宋春艷;譚琦;尚曉冬;陳明杰
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種香菇香九菌種的分子標記，其特征在于：該分子標記是基因SCAR的分子特異檢測標記，其PCR擴增的專用引物是香九F/R，香九F是5’GGTCCATGTATAGTCTG?3’，香九R是5’GTCCATTGGTTCAAAC?3’，PCR產物大小為750bp。

2.香菇香九菌種的分子標記的檢測方法，包括下列步驟：

(1)菌絲培養

將香菇菌種轉接到PDA平板上，23℃～25℃避光培養，10d～14d后接到100mL?PDY培養基中，100rpm～150rpm，23℃～25℃搖瓶培養10d～14d后收集菌絲；

(2)基因組DNA的提取

用改進的CTAB法提取菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；

(3)SCAR分子標記的檢測

將提取的DNA進行基因SCAR的PCR擴增；

(4)電泳檢測

上述PCR擴增產物與加樣緩沖液混勻，點樣于瓊脂糖凝膠上，電泳，用EB染色，在凝膠成像儀上照相，分析結果。

3.根據權利要求2所述的香菇香九菌種的分子標記的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中的改進的CTAB法：

1)將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，65℃保溫45min以上，間或輕搖混勻；

2)12000rpm，4℃離心20min，取上清液；

3)加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其混合液的混合體積比為25∶24∶1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

4)加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其混合液的混合體積比為24∶1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

5)加入2/3體積的-20℃預冷的異丙醇，輕輕搖動5min，8000rpm，4℃離心10min，去上清；

6)沉淀用體積百分數為75％的乙醇、10mmol/L醋酸鉀，洗滌2～3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

7)加入預冷的體積百分數為95％的乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

8)加入100μL?10×TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；

9)加入1μL?10mg/mL?RNaseA?37℃水浴，1hr，去除RNA；

10)DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

4.根據權利要求2所述的香菇香九菌種的分子標記的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中的PCR擴增的總體積為25μL，包括：10×PCR?buffer?2.5μL，25mmol/LMgCL₂?2μL，10mmol/L?dNTP?0.25L，2.5U/μL?Taq?DNA酶0.5μL，10μmol/L香九F/R引物各1μL，濃度1ng～10ng/μL提取的模板DNA?1μL，ddH₂O?18.6μL；

PCR反應條件：94℃?1min；94℃?15second，60℃?15second，72℃?1min，30個循環；72℃?5min。

5.根據權利要求2所述的香菇香九菌種的分子標記的檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的PCR擴增產物是8μL，加樣緩沖液為1μL，瓊脂糖凝膠為1.5％，電泳是在0.5×TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳。

6.一種香菇香九菌種的分子標記的應用，是利用香菇香九菌種基因SCAR的PCR擴增專用引物，進行基因SCAR擴增，存在SCAR標記的即是香菇香九菌種。