[發(fā)明專利]一種雙熒光蛋白分子細胞標(biāo)記的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810036837.6
• 申請日: 2008-04-30
• 公開（公告）號: CN101570758A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊淑偉;黃文韜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N5/10
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 繆利明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種雙熒光蛋白分子細胞標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)

熒光顯微技術(shù)為細胞生物學(xué)的研究提供了一個極為有用的工具，通過直觀的圖像，研究蛋白分子在細胞內(nèi)的動態(tài)行為。如蛋白分子的分泌，內(nèi)吞，運輸，定位，蛋白質(zhì)的出核與入核，細胞內(nèi)蛋白分子的相互作用等。傳統(tǒng)的方法是通過蛋白分子與標(biāo)簽蛋白(如GFP，YFP，F(xiàn)lag，HA.....)等融合表達，在細胞中通過GFP的自發(fā)熒光或者各種標(biāo)簽蛋白的相應(yīng)抗體偶聯(lián)的熒光分子受激發(fā)后所發(fā)出的各種不同波長的熒光而達到觀察的目的。

但由于抗體的方法抗體不能自由進入或細胞因此不適合于做活細胞的標(biāo)記，而GFP的方法雖然可以用于活細胞的標(biāo)記，但是由于GFP融合的蛋白會在發(fā)射波長上不斷的發(fā)射熒光，這對一些動態(tài)學(xué)的研究來說會有所影響，因此，很有必要提供一種新的標(biāo)記方法，以克服上述傳統(tǒng)方法中存在的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供了一種雙熒光蛋白分子重組質(zhì)粒，以進行雙熒光蛋白分子細胞標(biāo)記。

本發(fā)明還有一個目的在于，提供了一種雙熒光蛋白分子細胞標(biāo)記的方法。

本發(fā)明提供的用于雙熒光蛋白分子標(biāo)記法方法的重組質(zhì)粒，包含：1)編碼多肽A(即標(biāo)簽蛋白A)的DNA片段A，該標(biāo)簽蛋白可以特異地與其熒光底物共價的結(jié)合，其5’端或3’端可融合一段編碼待檢測蛋白C的DNA序列C；2)編碼多肽B(即標(biāo)簽蛋白B)的DNA片段B，該標(biāo)簽蛋白可以特異地與其熒光底物共價的結(jié)合，其5’端或3’端可融合一段編碼待檢測蛋白D的DNA序列D；3)片段A-C與B-D之間是由一段內(nèi)部核糖體插入位點元件的雙順反子ORF表達系統(tǒng)序列(IRES)DNA序列E連接在一起；4)在片段AC的上游的合適位置的一段負責(zé)DNA片段AC、E和BD的轉(zhuǎn)錄控制的DNA元件(即啟動子)。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述標(biāo)簽蛋白包括SNAP、Halo。

本發(fā)明提供的雙熒光蛋白分子細胞標(biāo)記的方法，包括以下步驟：構(gòu)建用于雙熒光蛋白分子標(biāo)記法方法的重組質(zhì)粒、細胞轉(zhuǎn)染和熒光標(biāo)記。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，使用本發(fā)明提供的標(biāo)記方法可在細胞的任一時像，例如有絲分裂期進行標(biāo)記。

使用本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒，可在同一個載體中協(xié)同共表達兩個目的基因，無需擔(dān)心共轉(zhuǎn)染的效率及其它共轉(zhuǎn)染過程中可能產(chǎn)生的問題，能很好的同時標(biāo)記同一細胞中的兩個不同蛋白，利用各自的底物帶上不同的熒光，在同一視野下能同時觀察兩種蛋白分子在細胞中的定位，兩種標(biāo)記方法相互之間不會有所干擾，可同時進行標(biāo)記，不會影響標(biāo)記的特異性，不會影響蛋白分子的正確定位；而且，標(biāo)記過程簡單，快速，能在15-30分鐘內(nèi)完成標(biāo)記，比傳統(tǒng)的抗體熒光標(biāo)記方法大大節(jié)省了標(biāo)記的時間，同時，其標(biāo)記方法可在細胞的任一時像進行標(biāo)記，因此可以觀測細胞在不同時像的目標(biāo)蛋白的情況。

附圖說明

圖1A是用于雙熒光蛋白分子標(biāo)記方法的重組質(zhì)粒示意圖。

圖1B是實例pTOM20-SNAP-IRES-LEF1-Halo重組質(zhì)粒示意圖。

圖2是內(nèi)部核糖體插入位點(IRES)雙順反子ORF表達系統(tǒng)示意圖。

圖3是電泳檢測結(jié)果圖，其中圖3A為擴增LEF1片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，圖3B為擴增SNAP?Tag片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，圖3C為擴增TOM20片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。

圖4是雙色熒光的共標(biāo)記檢測結(jié)果，其中，4A和4B分別為TOM20-SNAP(SNAP-cellTMR-Star)和LEF1-Halo(diAcFAM?Ligand)的定位結(jié)果，4C為TOM20-SNAP(SNAP-cell?TMR-Star)和LEF1-Halo(diAcFAM?Ligand)的共定位結(jié)果。

圖5是雙色熒光的共標(biāo)記檢測結(jié)果，其中，5A和5B分別為TOM20-SNAP0(SNAP-cellBG505)和LEF1-Halo(TMR?Ligand)的定位結(jié)果，5C為TOM20-SNAP0(SNAP-cellBG505)和LEF1-Halo(TMR?Ligand)的共定位結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆：實驗室手冊》(New?York：Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press，1989)中所述的條件進行。

實施例1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建